GnRHR在胃癌發(fā)生發(fā)展、分化及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)GnRHR在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性，探討GnRHR在胃癌發(fā)生發(fā)展、分化及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)48例術(shù)前未接受任何治療的胃癌患者病理標(biāo)本中腫瘤和腫瘤旁組織內(nèi)促性腺激素釋放激素受體（GnRHR）mRNA的表達(dá)；免疫組化分析腫瘤組織及腫瘤旁組織中GnRHR蛋白的表達(dá)。通過卡方檢驗(yàn)分析GnRHR表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，

2、采用Kaplan–Meier和秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，探討GnRHR表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。按腫瘤分化程度將48例胃癌患者腫瘤組織標(biāo)本分為分化差、分化良好兩組，應(yīng)用免疫組織化SP及原位定量法，對(duì)48例不同分化程度的胃癌組織中GnRHR、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)及半定量分析。Western blot檢測(cè)三種不同分化程度胃癌細(xì)胞中GnRHR表達(dá)情況；采用不同濃度(1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×

3、10-6mol/l)GnRH激動(dòng)劑醋酸曲普瑞林作用于三種不同分化程度的胃癌細(xì)胞株，MTT實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。Western blot檢測(cè)GnRHR及分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況。采用transwell小室檢測(cè)GnRH激動(dòng)劑醋酸曲普瑞林激活胃癌細(xì)胞GnRHR后細(xì)胞侵襲和遷移能力；Western blot檢測(cè)GnRHR激活后胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cad、vimentin及snail的表達(dá)情況。采用酪氨酸磷酸酶抑制劑正釩酸鈉激活EGF

4、R磷酸化后MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖分化相關(guān)蛋白及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：為了研究GnRHR在胃癌中的作用，我們通過RT-PCR及免疫組化分別檢測(cè)48例胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中GnRHR mRNA及GnRHR蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示GnRHR mRNA在胃癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(-10.06±1.28 vs-12.43±1.33，p<0.05)。GnRHR蛋白主要定位在細(xì)胞漿，在48

5、例胃癌患者中，超過一半胃癌組織中GnRHR染色陰性(52.08％,25/48)。為了探討GnRHR與胃癌患者臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，我們收集48例胃癌患者臨床及隨訪資料，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)：GnRHR mRNA表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)；GnRHR mRNA表達(dá)與患者總生存率相關(guān)，并且GnRHR mRNA低表達(dá)(-ΔCt<-10.06)患者總生存率較差(p=0.003;HR=0.42,95%CI:0.22-0.

6、87)。按腫瘤分化程度將48例胃癌患者腫瘤組織標(biāo)本分為分化差、分化良好兩組，各種不同分化的癌組織均顯示不同程度的 GnRHR和EGFR陽(yáng)性免疫反應(yīng)，GnRHR表達(dá)陽(yáng)性23例（47.92%），EGFR表達(dá)陽(yáng)性26例（54.16%），原位定量顯示GnRHR的表達(dá)分化良好20例、分化差3例，隨著組織分化程度增高而增高，EGFR的表達(dá)分化良好13例、分化差13例，隨著組織分化程度增高而降低（P<0.05）。相關(guān)性分析顯示：不同分化程度胃癌組織中

7、GnRHR與EGFR表達(dá)成負(fù)相關(guān)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；為了進(jìn)一步探討 GnRHR與 EGFR的相關(guān)性以及GnRHR在胃癌的發(fā)生發(fā)展、分化及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，我們通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移三方面進(jìn)行研究。
　　結(jié)果顯示：不同濃度醋酸曲普瑞林作用胃癌細(xì)胞不同時(shí)間抑制胃癌細(xì)胞增殖，western blot結(jié)果顯示GnRHR通過EGFR-ERK通路抑制胃癌細(xì)胞增殖；此外，GnRHR在不同分化程度胃癌細(xì)胞中表

8、達(dá)不同，分化程度越高，GnRHR表達(dá)越高，進(jìn)一步western blot結(jié)果顯示GnRHR通過EGFR-CDK1通路調(diào)控胃癌細(xì)胞分化；胃癌組織中GnRHR與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，為了從細(xì)胞水平研究GnRHR對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，采用醋酸曲普瑞林誘導(dǎo)GnRHR表達(dá)后transwell小室檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示：醋酸曲普瑞林作用于胃癌細(xì)胞后，透膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。提示誘導(dǎo)GnRHR表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。進(jìn)一步western