柿原花青素前體跨膜及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因MATE、GST的表達(dá)分析及功能驗(yàn)證.pdf

1、柿果肉液泡中積累大量的原花青素(PAs)是導(dǎo)致果肉產(chǎn)生澀感的主要原因，雖然PAs的前體物質(zhì)產(chǎn)生于細(xì)胞質(zhì)，但其最終聚合與存儲均在液泡中。已有研究表明MATE是一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能轉(zhuǎn)運(yùn)原花青素的前體物質(zhì)進(jìn)入液泡，也有研究表明不同物種GST能向液泡定向轉(zhuǎn)運(yùn)花青素或原花青素的前體等類黃酮物質(zhì)進(jìn)入液泡，但柿中這兩類基因的功能尚不清楚。本研究以中國甜柿‘羅田甜柿'(Diospyros kakiThunb.‘Luotian Tianshi'，C-PCNA

2、)為試材，以非完全甜柿‘磨盤柿'(‘Mopanshi'，non-PCNA)和日本甜柿‘陽豐'(‘Youhou'，J-PCNA)為對照，研究柿果肉中可溶性、不溶性PAs的相對含量以及單果中可溶性、不溶性PAs的含量的動態(tài)變化;分析DkMATE1、DkGSTL基因在不同脫澀類型(C-PCNA、non-PCNA、J-PCNA)、不同發(fā)育時期、不同組織部位的表達(dá)模式;在‘磨盤柿'、‘恭城水柿'和‘次郎'中通過遺傳轉(zhuǎn)化（葉盤）法，分別超表達(dá)和干涉

3、DkMA TE1/DkGSTL基因，分析轉(zhuǎn)基因材料中PAs合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的表達(dá)情況，通過分析DkMA TE1和DkGSTL與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量模式的關(guān)系，推測它們在PAs前體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用并討論其在中國甜柿自然脫澀中可能的作用。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴不同脫澀類型柿每果PAs含量、PAs相對含量隨果實(shí)發(fā)育的變化。可溶性、不溶性和PAs百分含量均在2.5 WAB（花后2.5周）最高，隨果實(shí)生長發(fā)育其含量逐漸降低。‘陽豐'

4、在10 WAB其可溶性PAs百分含量下降至0.2％以下，完成自然脫澀，而‘羅田甜柿'和‘磨盤柿'尚未脫澀，到25 WAB‘羅田甜柿'自然脫澀，但‘磨盤柿'可溶性PAs含量以及PAs百分含量仍然較高，不能自然脫澀。與日本甜柿‘陽豐'不同的是，在10和15 WAB之間‘羅田甜柿'其不溶性PAs百分含量具有上升趨勢。⑵DkMA TE1和DkGSTL在不同脫澀類型、發(fā)育時期及部位中的表達(dá)。DkMA TE1在葉中表達(dá)量最高，DkGSTL在萼片表達(dá)

5、量最高，表明兩基因?yàn)榉枪麑?shí)特異性表達(dá)基因。DkMATE1在‘羅田甜柿'10和15 WAB表達(dá)量有上升趨勢，而在‘陽豐'中表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)量低于‘羅田甜柿'，推測D kMA TE1編碼的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對PAs前體的運(yùn)輸有選擇偏好性，從而導(dǎo)致中國甜柿與日本甜柿PAs成分差異，致使兩者自然脫澀機(jī)理的不同。⑶DkMATE1和DkGSTL的功能驗(yàn)證。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在‘磨盤柿'、‘恭城水柿'和‘次郎'中超表達(dá)、干涉D kMA TE1和Dk

6、GSTL，經(jīng)鑒PCR初步定獲得陽性轉(zhuǎn)基因材料，陽性率介于3.41％-9.49％之間。對轉(zhuǎn)基因材料中PAs合成相關(guān)基因的表達(dá)，其結(jié)果顯示kMA TE1和DkGSTL對DkANR、DkMYB4和DkPA1的表達(dá)影響較大。超表達(dá)DkMATE1和DkGSTL后，上述3個基因表達(dá)上調(diào)明顯，推測細(xì)胞質(zhì)中PAs前體物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因的超表達(dá)，能增強(qiáng)對上游前體合成基因的表達(dá)，同時干涉DkMA TE1和DkGSTL，上述3基因的表達(dá)量急劇降低，說明他們能協(xié)調(diào)P