沙棘原花青素的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、沙棘(Hippopha(e)rhamnoides)是我國蒙醫(yī)、藏醫(yī)的習用藥材,已有千余年的歷史,大量的研究結(jié)果表明:沙棘在其果子、葉片、種子、樹皮中含有多種營養(yǎng)活性成分,具有抗癌、抗氧化、抗輻射、抗血栓、增強肌體活力和免疫力、消炎、抑菌、止痛和促進組織再生的功效。人們對于沙棘中維生素C、類胡蘿卜素、黃酮、脂肪和多糖等成分在生理和藥理方面的活性研究較多。然而,沙棘作為原花青素的新資源,無論是其化學結(jié)構(gòu)還是其生物活性的系統(tǒng)研究均鮮見報道,因

2、此沙棘中原花青素的深入研究將對沙棘資源的深度開發(fā)和利用具有重要的理論和實際意義。
   本課題綜合運用了色譜及波譜等現(xiàn)代分離、分析技術(shù)和化學分析方法,對沙棘莖皮中原花青素的結(jié)構(gòu)進行了分析與鑒定,同時采用現(xiàn)代醫(yī)學、生物學技術(shù)和手段,著重研究了沙棘原花青素的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗胃潰瘍作用,并對其作用機制進行了探討。
   主要研究結(jié)果如下:
   1.沙棘中原花色素的含量測定和提取純化
   對沙棘各部分原

3、花色素含量進行了測定,結(jié)果顯示沙棘籽和莖皮的含量較高,其中沙棘籽的含量高達9.67%,莖皮中的含量為4.42%。以沙棘籽為原料,比較了提取劑、溫度、pH值等因素對沙棘籽原花色素(以下簡稱SBPAs)提取效果的影響,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交實驗優(yōu)化,確定了最佳提取條件:以65%的乙醇水溶液作為提取劑,提取溫度21℃,pH5.1,料液比為1:10,提取三次,每次90min。提取得率為5.10%。
   通過對16種樹脂的動態(tài)吸

4、附與靜態(tài)吸附試驗的比較,以D3520大孔吸附樹脂用于沙棘籽原花色素提取物的純化為宜,30%乙醇洗脫液中原花色素的含量達到96%以上,回收率為30%。
   2.沙棘莖皮中原花青素B3的結(jié)構(gòu)鑒定
   對沙棘莖皮提取物經(jīng)D3520大孔吸附樹脂純化得到的30%乙醇洗脫液(SBPC)進行NP-HPLC和RP-HPLC-MS分析,結(jié)果表明,SBPC中含有原花青素單體(兒茶素和表兒茶素)以及至少含有三種二聚體和三聚體,其對應(yīng)分子量

5、分別為290,578,866。
   采用Toyopearl HW-40S凝膠色譜以100%甲醇洗脫SBPC,得到四個組分(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ)。其中組分Ⅰ經(jīng)NP-HPLC和RP-HPLC-MS分析為一單峰,因此命名為CompoundⅠ,DAD分析顯示其具有典型的原花青素特征光譜圖。負離子模式分析得到的準分子離子的m/z為577,對應(yīng)的二級質(zhì)譜碎片為289和425,為典型的B型二聚體的特征碎片。通過過量間苯三酚存在條件下的酸水解,得

6、到的末端單元經(jīng)與標準品比對為兒茶素,進一步采用一維和二維核磁共振波譜的分析,鑒定該化合物是2個兒茶素通過C4-C8鍵連結(jié)的原花青素二聚體B3。
   3.SBPC和B3的抗氧化活性研究及比較
   本文通過體外抗氧化實驗,研究了SBPC對羥自由基、紅細胞溶血、肝臟與肝線粒體中的脂質(zhì)過氧化以及肝線粒體腫脹度的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBPC能夠有效地清除羥自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,保護生物膜,減少紅細胞溶血,減輕肝線粒體腫脹程度,提示

7、SBPC具有很強的抗氧化能力。
   采用CuSO4-Phen-VC-H2O2化學發(fā)光體系、鄰苯三酚一魯米諾發(fā)光體系、H2O2-魯米諾發(fā)光體系和CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA發(fā)光體系分別測定了SBPC和B3對羥自由基、超氧陰離子自由基、H2O2的清除效果及對DNA的保護作用,結(jié)果顯示二者均具有極強的抗氧化能力,進一步提純后得到的單一組分B3的抗氧化活性高于混合物SBPC。
   4.SBPC對大鼠應(yīng)激性胃潰

8、瘍的預防作用研究
   以大鼠浸水束縛應(yīng)激建立急性胃潰瘍模型,造模前灌胃不同劑量的SBPC(50mg,100,150mg/kgbw)或Ranitidine陽性藥物(30mg/kgbw)。測定潰瘍指數(shù)、大鼠胃液中胃酸含量和胃蛋白酶活性、大鼠的血漿中血漿皮質(zhì)醇(Cor)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和大鼠血漿表皮生長因子(EGF)及NO水平等生化指標;通過免疫組化的方法分析了胃粘膜組織中iNOS的表達;表皮生長因子受體(EGFR)及

9、細胞核增殖抗原PCNA的表達;采用原位末端標記法檢測了胃粘膜上皮細胞的凋亡。透射電鏡觀察和分析了大鼠胃粘膜的超微細胞結(jié)構(gòu)。與對照組相比,高劑量組SBPC(150mg/kgbw)的潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.01)。SBPC能抑制胃酸的分泌(P<0.01),降低胃蛋白酶活性(P<0.01),及血漿中Cor、ACTH、NO的水平(P<0.01),同時能抑制粘膜中iNOS的表達,及顯著升高血漿EGF的水平(P<0.05),降低血漿中NO的濃度(

10、P<0.01);及NOS和iNOS的活力(P<0.05),使粘膜中的iNOS的表達降低(P<0.01),增強EGFR和PCNA的表達分別達到顯著和及顯著水平(P<0.01,P<0.05),凋亡指數(shù)也顯著降低(P<0.05)。研究顯示預先給予急性胃潰瘍大鼠150mg/kgbw SBPC,可以有效緩解應(yīng)激引發(fā)的胃粘膜損傷。這種作用的機理是復雜的,可能是SBPC通過調(diào)控ACTH、Cor的分泌來影響胃酸的分泌,這與超微細胞結(jié)構(gòu)的觀察相一致,也有

11、可能是SBPC通過調(diào)節(jié)EGF及EGFR和NO水平促進大鼠的細胞增殖抑制細胞凋亡來實現(xiàn)的,這一結(jié)果也從PCNA的表達上調(diào)得到支持。
   5.SBPC對大鼠乙酸性胃潰瘍愈合的促進作用
   通過漿膜下注射乙酸建立慢性胃潰瘍模型,造模后灌胃不同劑量的SBPC(50mg,100,150mg/kgbw)或(Ranitidine陽性藥物,30mg/kgbw)。治療7天后、14天后分別處死動物。通過測定潰瘍指數(shù)和大鼠的血漿中EGF以

12、及免疫組化的方法測定第七天胃粘膜潰瘍組織周圍EGFR、PCNA的表達,以及粘液中PAS染色陽性的比率,觀察了SBPC對大鼠乙酸性胃潰瘍的促進作用。結(jié)果顯示,與對照組相比,SBPC各劑量組的潰瘍指數(shù)明顯降低,均能迅速提高血漿中EGF的水平,同時SBPC高劑量組(150mg/kgbw)大鼠胃粘膜EGFR及PCNA的表達也顯著增強(P<0.01,P<0.05),且中性粘液的分泌量增加(P<0.01)。提示SBPC對大鼠乙酸性胃潰瘍的愈合促進作

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