莪蓮柴胡湯對裸鼠人肝細(xì)胞肝癌模型的抗癌作用研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary hepatic cailcer，PHC)，簡稱肝癌，系原發(fā)于肝細(xì)胞和/或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，包括肝細(xì)胞癌、肝管細(xì)胞癌和混合癌。具有發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快、治療難、預(yù)后差的特點(diǎn)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病。是世界上發(fā)病率最高的10種腫瘤之一，占全世界每年新發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的4﹪，我國肝癌病例數(shù)約占全世界肝癌總例數(shù)的43.7﹪。就死亡率而言，肝癌在全球男性惡性腫瘤中居第7位，女性中居第9位。我國肝

2、癌死亡率居惡性腫瘤死亡率的第2位，僅次于胃癌。由于肝癌的發(fā)病機(jī)制不明確，目前缺乏針對此病的特異性治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采用外科手術(shù)、化療、放療、介入治療等綜合治療，其總體療效并不樂觀，其發(fā)病率及死亡率有逐步升高的趨勢。 中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，雖然無肝癌的病名，但相似的癥狀和體征記載十分豐富，多屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”、“癥瘕”、“黃疸”、“臌脹”、“脅痛”等范疇。一般認(rèn)為，本病的發(fā)生是由于正氣不足，臟腑功能失調(diào)，氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而形成的。肝癌的

3、病因病機(jī)總的來說是本虛標(biāo)實，以脾虛為本，氣滯、血瘀、濕熱、毒邪為標(biāo)。 導(dǎo)師陳澤雄副教授依據(jù)中醫(yī)對肝癌“正虛邪實”、“本虛標(biāo)實”這一發(fā)病機(jī)制的根本認(rèn)識，認(rèn)為邪正關(guān)系始終是肝癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵，故“扶正祛邪”是治療肝癌的根本大法。莪蓮柴胡湯是導(dǎo)師對肝癌中醫(yī)臨床治療經(jīng)驗的總結(jié)，具有健脾疏肝、解毒散結(jié)的功效。既往導(dǎo)師陳澤雄和師兄胡洪濤應(yīng)用本方的臨床和基礎(chǔ)研究證明其對中晚期肝癌或體外癌細(xì)胞具有一定的治療作用，可改善臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，

4、抑制端粒酶活性等作用。因此，在活體中進(jìn)一步探討本方的抗癌作用機(jī)制，闡明其藥理活性意義重大。研究目的研究莪蓮柴胡湯對間接原位移植雄性裸鼠肝癌模型的抗癌作用。 1、探討運(yùn)用人類肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株行間接“原位移植雄性裸鼠肝癌模型”的建立。 2、分析莪蓮柴胡湯對該模型解剖及生存情況的影響。 3、分析莪蓮柴胡湯對該模型肝組織、肝癌旁組織、肝癌組織PTEN蛋白陽性表達(dá)的影響及其在3種組織中的表達(dá)強(qiáng)度。 材料 1

5、、造模材料人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Bel-7402；BALB/c裸鼠，雄性，4～6周齡，60只。 2、干預(yù)材料莪蓮柴胡湯濃縮劑；FT207注射液(替加氟注射液)。 3、試劑兔抗人PTEN多克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑。 實驗方法 1、造模采用Bel-7402人肝癌細(xì)胞株復(fù)制裸鼠“間接肝原位移植瘤模型”。 2、干預(yù)裸鼠在無特殊病原菌(SPF)條件下分籠飼養(yǎng)。將裸鼠隨機(jī)分為5組，造模裸鼠4組(中藥高、中、

6、低濃度組和FT-207化療組)，每組各12只，4組模型鼠術(shù)后即進(jìn)入實驗?？诜o藥，0.2ml藥液/10g體重，每天一次，連續(xù)4周。第5組不造模，與0.2ml生理鹽水/10g體重灌服，作解剖對照。 3、處理觀察過程中，記錄瘤鼠的生存時間。治療結(jié)束，裸鼠眼球采血后處死解剖，記錄瘤體積、瘤指數(shù)(瘤重/體重)、肝指數(shù)(肝重/體重)、脾指數(shù)(脾重/體重)，并將正常肝組織、癌旁組織和癌組織標(biāo)本用4﹪中性甲醛溶液固定，送病理石蠟包埋切片。

7、 4、病理檢測組織學(xué)檢測，用常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE)；免疫組化檢測，采用二步法免疫組化檢測方法檢測PTEN蛋白表達(dá)；染色結(jié)果評估，采用Bresalier半定量公式判斷染色結(jié)果；讀片，雙人雙盲閱片，共2次，分別計算IS，取2次的平均數(shù)作為結(jié)果。 5、統(tǒng)計學(xué)分析：計量正態(tài)資料用“x±s”表示，非正態(tài)計量資料用“中位數(shù)(極值)”表示，計數(shù)資料用“部分/總體”，資料采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件計量資料進(jìn)行T檢驗、方差分析、秩

8、和檢驗、計數(shù)資料采用卡方檢驗、秩和檢驗。 結(jié)果 1、解剖證實造模成功率48/48；實驗結(jié)束獲得有效病理標(biāo)本48例。成瘤以單發(fā)巨塊型為主，部分伴肝內(nèi)和/或肺內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移，符合人類肝癌解剖特點(diǎn)。 2、牛存情況分析：治療組生存時間均長于化療組，p<0.05或0.01。 3、體重變化分析：結(jié)果說明中藥可能在保持瘤鼠體重，減輕腫瘤對機(jī)體的消耗、控制惡液質(zhì)的進(jìn)展比替加氟有效，p<0.05。 4、解剖情況分析：中

9、藥治療與替加氟治療比較不能減小瘤體積，p>0.05；但在抑制肝脾腫大上中藥治療優(yōu)于FT-207治療，p<0.05，且以高濃度組效果最好，p<0.01；治療組瘤鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)移少于對照組，p<0.05。 5、抑癌基因PTEN表達(dá)分析：結(jié)果說明瘤鼠肝臟PTEN蛋白表達(dá)強(qiáng)度癌旁組織最高，癌組織最低，正常肝組織次之，p<0.05。中藥治療該肝癌動物模型與替加氟對比，可以明顯提高抑癌基因PTEN的表達(dá)，p<0.05。 結(jié)論 1、

10、本研究所采用肝癌動物模型是研究肝癌治療較為理想的實驗動物模型。 2、中高濃度(0.5g生藥/kg體重和1.0g生藥/kg體重)莪蓮柴胡湯可以延長Bel-7402間接原位移植肝癌裸鼠模型的生存時間，提高生存率。 3、不同濃度莪蓮柴胡湯能夠控制該模型體重減輕，提高生存質(zhì)量；能夠減少該模型肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率，減輕病情；能夠降低肝脾腫大增生；以中高濃度(0.5g生藥/kg體重和/或1.0g生藥/kg體重)為佳。 4、不同濃度