Bevacizumab對人肝癌細(xì)胞的直接抑制及聯(lián)合吉西他濱對荷肝癌裸鼠的治療作用研究.pdf

1、Bevacizumab是針對血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)人工合成的一種重組人源化單克隆抗體。目前已被美國FDA批準(zhǔn)為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線、二線治療，非小細(xì)胞肺癌的一線治療，轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳腺癌的治療。近期多項(xiàng)研究Bevaeizumab對肝癌的臨床療效的I期、II期臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明Bevacizumab單藥以及聯(lián)合其他化療藥物或分子靶向藥物都有一定的抗腫瘤療效。

2、 目前，單藥Bevacizumab抗腫瘤治療已有一定的療效，但是多項(xiàng)臨床前實(shí)驗(yàn)證明了Bevacizumab聯(lián)合化療藥物治療腫瘤比其單藥治療療效好。近年世界上多個(gè)國家都在進(jìn)行吉西他濱治療肝癌的臨床研究，但其單藥有效率在20％以下。而Bevacizumab可增加傳統(tǒng)化療藥物治療實(shí)體瘤的療效，包括結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌。近期也有多項(xiàng)臨床研究證明了Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱或其他化療藥物治療肝癌的有效性。 因此，本研究旨在探討B(tài)e

3、vacizumab對人肝癌細(xì)胞的增殖影響及機(jī)制，Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對荷肝癌裸鼠的治療作用。 第一部分：肝癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子自分泌機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 一、研究方法和內(nèi)容： 1、采用RT—PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)的方法分析肝癌細(xì)胞株中VEGF、Flt-1、KDR基因和蛋白水平的表達(dá)：選用兩株肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC—7721，內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304作為VEGF受體表達(dá)的陽性對照，從中篩選VEGFm

4、RNA表達(dá)量高，F(xiàn)lt-1、KDR均為陽性表達(dá)的肝癌細(xì)胞株，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。 2、外源性rhVEGF對肝癌細(xì)胞的影響：無血清條件下，12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/mlrhVEGF作用于肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞72h后，行MTT檢測其增殖情況，并用單因素方差分析不同濃度rhVEGF對肝癌細(xì)胞株的促進(jìn)增殖作用；通過RT—PCR檢測100ng/mlrhVEGF作用肝癌細(xì)胞后VEGF、Flt

5、-1、KDRmRNA的表達(dá)量，與空白對照組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 二、主要結(jié)果： 1、RT—PCR結(jié)果示：肝癌細(xì)胞株HepG2中均有VEGF、Flt-1、KDRmRNA的表達(dá)，而SMMC—7721中只有VEGF、Flt-1mRNA的表達(dá)；且HepG2中VEGF、Flt-1mRNA的表達(dá)量均高于SMMC—7721(VEGFmRNA：t=9.056，P=0.001；Flt-1mRNA：F=55.975，P=0.000)；免

6、疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果示：HepG2見VEGF、Flt-1及KDR的表達(dá)，SMMC—7721見VEGF、Flt-1的表達(dá)，無KDR的表達(dá)。因此，我們選用VEGF高表達(dá)和Flt-1、KDR均表達(dá)的HepG2細(xì)胞作為研究Bevacizumab對肝癌細(xì)胞直接作用的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。 2、不同濃度rhVEGF對肝癌細(xì)胞株HepG2均有促進(jìn)增殖的作用，12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組OD值與對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P值分別為0.023，0.002，0.000，0.000)。在25～100ng/ml范圍內(nèi)其促進(jìn)作用隨rhVEGF濃度的增高而增強(qiáng)；其VEGF、KDRmRNA表達(dá)量均增加(t值分別為：22.450和9.086，P值分別為：0.000和0.001)，而Flt-1mRNA表達(dá)量無明顯變化(t=1.225，P=0.288)。 三、主要結(jié)論： 1、人肝癌細(xì)胞株中存在VEGF及其受體的共同表達(dá)。 2、rhVEGF對肝癌細(xì)

8、胞株HepG2有促進(jìn)增殖的作用，且呈劑量依賴性，此作用可能是通過KDR介導(dǎo)的，同時(shí)隨著腫瘤細(xì)胞的增殖，其VEGF進(jìn)一步表達(dá)，從而使得VEGF和其受體KDR的相互作用加強(qiáng)。 3、肝癌細(xì)胞中可能存在VEGF的自分泌機(jī)制，且該機(jī)制是通過KDR介導(dǎo)的。 第二部分：Bevacizumab直接抑制肝癌細(xì)胞體外增殖的實(shí)驗(yàn)研究 一、研究方法和內(nèi)容： 1、MTT法檢測Bevacizumab對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用：無血清條

9、件下，0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h，采用單因素方差分析(LSD法)比較不同濃度間及與對照組的增殖情況。 2、AnnexinV—FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡：無血清條件下，10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h后，經(jīng)AnnexinV—FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較Bevacizumab組和

10、對照組。 3、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化：無血清條件下，10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h后，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算各期細(xì)胞所占比例。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較Bevacizumab組和對照組。 4、RT—PCR分析肝癌細(xì)胞株VEGF、Flt-1、KDRmRNA表達(dá)量的變化：無血清條件下，10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細(xì)胞48h后，行RT—PCR檢測。采用獨(dú)立樣本t檢

11、驗(yàn)比較Bevacizumab和對照組。 二、結(jié)果： 1、不同濃度Bevacizumab對肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖有抑制作用。0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組細(xì)胞增殖抑制率分別為8.8％、27％、32％、26％。其中1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.001，0.000，0.001)，但此三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

12、 2、Bevacizumab可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2的凋亡。Bevacizumab組的細(xì)胞凋亡率為(17.04±0.14)％，明顯高于對照組(2.85±0.08)％(t=198.533，P=0.000)。 3、Bevacizumab可引起肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞周期變化。其中，S期細(xì)胞無明顯變化(t=0.477，P=0.646)；G1期的細(xì)胞增加(t=13.457，P=0.000)，G2期的細(xì)胞減少(t=16.787，P=

13、0.000)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、Bevacizumab作用于肝癌細(xì)胞株HepG2后，其VEGF、KDRmRNA表達(dá)量均減少，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為：12.476和5.071，P值分別為：0.000和0.007)；而Flt-1mRNA表達(dá)量與空白對照組比較無顯著差異(t=2.449，P=0.07)。 三、結(jié)論： 1、Bevacizumab作用于肝癌細(xì)胞株HepG2后，細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞

14、凋亡率增高。 2、Bevacizumab對HepG2的增殖抑制作用可能是通過KDR介導(dǎo)的，同時(shí)隨著腫瘤細(xì)胞的增殖抑制，其VEGF表達(dá)量減少。 3、Bevacizumab可能通過阻滯VEGF的自分泌作用而發(fā)揮對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。 第三部分：Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對荷肝癌裸鼠的治療作用研究 一、研究方法和內(nèi)容： 建立人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤模型，每隔3天觀察一次，用游標(biāo)卡尺測量

15、腫瘤的大小，當(dāng)腫瘤直徑長至0.4～0.6cm時(shí)，即用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分A組：空白對照組，予以無菌生理鹽水，0.2ml/只；B組：Bevacizumab組，5mg/kg；C組：吉西他濱組，100mg/kg；D組：Bevacizumab5mg/kg+吉西他濱100mg/kg聯(lián)合組。各組給藥均為2次/周，共4周，腹腔注射。自接種后第19天起，每周檢測腫瘤體積。連續(xù)給藥4周后停藥一周，處死裸鼠，取移植瘤組織進(jìn)行CD34染色檢測各組微血管密度(MVD

16、)。對照組與各治療組間移植瘤體積比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；對照組與各治療組間MVD的比較采用單因素方差分析。 二、主要結(jié)果： 1、各治療組給藥后體積與對照組相比增長均較緩慢，Bevacizumab組、吉西他濱組、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組的抑瘤率分別為40.35％、45.61％、84.21％，其中Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組最為明顯。Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱與Bevacizumab、吉西

17、他濱組之間均有顯著差異(P值分別為0.004，0.010)。 2、與對照組比較，單藥吉西他濱組MVD無顯著差異(P=0.267)；單藥Bevacizumab組及聯(lián)合吉西他濱組的MVD均減少，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)；Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組的MVD減少較Bevacizumab組更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 三、結(jié)論： 1、Bevacizumab可抑制荷肝癌