差異基因表達譜分析小鼠燒傷早期刺激反應相關基因靶標.pdf

1、本實驗包括兩個部分:
　　第一部分 小鼠燒傷早期刺激反應相關基因靶標的篩選
　　目的：
　　利用生物信息學方法對小鼠燒傷早期免疫細胞差異基因表達譜進行分析，以期對小鼠燒傷后免疫細胞應對刺激反應過程的機制加以了解，為篩選出燒傷早期應對刺激反應相關治療靶標。
　　方法：
　　1.基因芯片數(shù)據(jù)篩選:從NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.

2、nih.gov/geo/）進行基因芯片樣本篩選，樣本需滿足以下篩選條件:①燒傷動物模型，TBSA＞20％，Ⅲ度燒傷或燙傷;②燒傷或燙傷分組時間少于48小時:③樣本及對照數(shù)目大于3。最終經(jīng)過芯片質量評估，歸類整理后發(fā)現(xiàn)，由Lederer JA等提交的GSE7404（動物模型為小鼠，25％TBSA，Ⅲ度燒傷）數(shù)據(jù)集滿足以上篩選條件。我們從中選取燒傷后第1天組免疫細胞樣本數(shù)據(jù)進行分析，總共有8個樣本符合條件，其中4個為燒傷組，4個為對照組。本

3、研究所需GSE7404數(shù)據(jù)是GPL1261平臺Affymetrix Mouse Genome4302.0Array基因芯片，為全血游離白細胞基因芯片。
　　2.基因芯片數(shù)據(jù)的處理:由于基因芯片平臺的差異、系統(tǒng)誤差的存在和后期計算的需要，我們對基因芯片數(shù)據(jù)進行分析之前，需要先進行預處理(pre-procession)。預處理的過程主要包括:數(shù)據(jù)過濾，去除異常數(shù)據(jù)和噪音數(shù)據(jù);補缺失值，保證數(shù)據(jù)的完整性;對數(shù)轉換，以滿足正態(tài)分布的分析要

4、求;標準化，糾正系統(tǒng)誤差，以發(fā)現(xiàn)真正的生物學變異。
　　3.功能富集分析:在本次研究中，我們應用GO-function數(shù)據(jù)包對基因進行功能注釋，以有效的處理GO功能中的冗余，使分析結果更加可靠精確。應用DAVID數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)對基因數(shù)據(jù)進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and

5、Genomes)通路富集分析。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）是由日本京都大學和東京大學聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片數(shù)據(jù)基因功能分析方法，它利用的數(shù)據(jù)是一些已經(jīng)研究清楚的基因之間的相互作用，即就是生物通路。本研究通過DAVID數(shù)據(jù)庫所篩選刺激反應相關差異基因，并選取刺激反應相關差異基因進行KEGG通路富集分析后，選取與燒傷后

6、免疫細胞刺激反應相關通路。
　　4.刺激反應相關基因蛋白互作網(wǎng)絡構建及分析:將選取的免疫系統(tǒng)相關差異基因應用DAVID進行基因ID轉換，將轉換的差異基因輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫中，選取交互作用評分大于0.4（中等可信度）的互作關系構建刺激反應相關差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡（Protein-protein interaction network）。網(wǎng)絡分析及MCL子網(wǎng)絡聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進行。ST

7、RING數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de)是一個搜尋已知蛋白質之間和預測蛋白質之間相互作用的系統(tǒng)，它不僅包括蛋白質與蛋白質之間直接的物理的相互作用，而且包括蛋白質與蛋白質之間間接功能的相關性。Cytoscape作為一個開源性網(wǎng)絡分析和可視化數(shù)據(jù)分析軟件，目前它可以將生物分子交互網(wǎng)絡與高通量基因表達數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息整合建構可視化的分子交互作用網(wǎng)絡，并且對大規(guī)模蛋白質和蛋白質之間相互作用、蛋白質和DNA之間等交互作

8、用的關聯(lián)性進行分析。
　　結果：
　　1.基因芯片分析結果:在燒傷后第一天差異基因進行基因功能本體(GO)分析顯示，共有259個刺激反應相關差異基因被選出，其中上調基因118個，下調基因141個。通過KEGG通路富集結果顯示前10個通路符合閾值要求并被顯著富集。主要為包括免疫系統(tǒng)相關通路（toll樣受體信號通路;B細胞受體信號通路;T細胞受體信號通路等）;細胞過程中的細胞生長與死亡相關通路(p53信號通路;細胞凋亡通路);環(huán)

9、境信息進程中的信號轉導相關通路。其中差異基因富集最多、最顯著的為toll樣受體信號通路。
　　2.刺激反應相關蛋白互作網(wǎng)絡分析:在刺激反應相關蛋白互作網(wǎng)絡圖中共由226個節(jié)點，1232條邊組成，在蛋白互作網(wǎng)絡中位于中心位置并且與其他蛋白或基因具有最大互作關系的蛋白或者基因在生物學過程中具有更重要的意義。在蛋白互作網(wǎng)絡圖中我們發(fā)現(xiàn)Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2(Stress=56)、Stat

10、3(Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2(Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck(Stress=38)、Ptpn6(Stress=38)10個基因位于網(wǎng)絡中心，具有最高互作關系。為了篩選出與刺激反應過程相關的重要的節(jié)點基因，我們通過MCL分析方法對原始蛋白互作網(wǎng)絡進行聚類分析，選取力度系數(shù)大于4.0，互作關系大于6的網(wǎng)絡模塊進行下一步分析。我們發(fā)現(xiàn)MCL分析

11、總共有7個子網(wǎng)絡被選出。
　　結論：
　　通過對小鼠燒傷后一天全血游離白細胞基因芯片分析我們發(fā)現(xiàn)Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因在燒傷早期應對刺激反應過程中可能發(fā)揮重要的作用，是潛在的生物靶標。
　　第二部分 運用熒光定量PCR技術驗證靶標基因
　　目的：
　　通過動物學實驗來驗證小鼠燒傷后刺激反應相關重要靶標基因。
　　方法：
　　動物分組及燙傷模型建立:選取50只健康成

12、年BALB/c小鼠，體重22-24g，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，并清潔級飼養(yǎng)。分組:假燒傷（Sham）組10只，實驗組40只，實驗組按燙傷后時間分為燙傷后2h、6h、12h和24h組。模型建立:小鼠用1％的戊巴比妥鈉(50m g/kg)腹腔麻醉后，將小鼠背部備皮，盡量不傷及皮膚，硫化鈉去盡背部毛發(fā)，背部脫毛區(qū)域大小4*4cm（約25％TBSA），將小鼠固定于操作板上。將小鼠背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒（導致25

13、％Ⅲ度燙傷創(chuàng)面），燙傷后立即腹腔注射0.9％無菌生理鹽水1ml抗休克處理，創(chuàng)面使用碘伏消毒后，再無菌紗布包扎。根據(jù)時間點行眼部取血，并提取血液中的白細胞，最后用Real-time qPCR法檢測小鼠燒傷后白細胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表達情況。
　　結果：
　　1.以MM-GAPDH為內參，我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA的相

14、對表達量。以sham組為對照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Lck mRNA相對表達量(x±s)如下:0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±0.120、0.536±0.131，各組與對照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Lck mRNA的表達量在12h處于較低水平，在燙傷后24h內整體表達下降趨勢。
　　2.以MM-GAPDH為內參，我們使用熒光定量PCR

15、技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA的相對表達量。以sham組為對照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-1 mRNA相對表達量(x±s)如下:0.780±0.127、0.527±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110，各組與對照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Stat-1 mRNA的表達量在24h處于最低水平，在燙傷

16、后24h內整體表達持續(xù)下降趨勢。
　　3.以MM-GAPDH為內參，我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA的相對表達量。以sham組為對照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Myd88 mRNA相對表達量(x±s)如下:1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200，各組與對照組相比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0

17、.05)。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，小鼠燙傷后Myd88 mRNA的表達量在2h表達量明顯增加，在燙傷后24h內表現(xiàn)出持續(xù)高表達。
　　4.以MM-GAPDH為內參，我們使用熒光定量PCR技術檢測了小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA的相對表達量。以sham組為對照，小鼠燙傷后2h、6h、12h、24h白細胞中Stat-3 mRNA相對表達量(x±s)如下:1.424±0.107、1.529±0.094、1.39