差異基因表達(dá)譜分析并檢測小鼠燒傷早期免疫相關(guān)基因靶標(biāo)的表達(dá).pdf

1、研究背景：
　　嚴(yán)重?zé)齻麑⒁饳C(jī)體免疫功能的紊亂，而后者則被認(rèn)為是導(dǎo)致燒傷患者發(fā)生多種難以控制的并發(fā)癥如多器官功能障礙綜合征(MODS)、全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）的重要因素之一?，F(xiàn)階段針對(duì)燒傷后免疫功能變化的研究多是對(duì)免疫細(xì)胞及免疫因子的作用機(jī)制入手，亦或者從感染是器官功能損害方面出發(fā)，并無對(duì)燒傷后基因轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行深入的研究與分析。而對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)的分析以及生物信息學(xué)技術(shù)的應(yīng)用能幫助尋找出在燒傷早期潛在的診斷及治療的靶標(biāo)

2、。
　　本課題組在前期選取并研究分析了GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中小鼠燒傷后早期白細(xì)胞基因芯片的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)燒傷后小鼠白細(xì)胞表現(xiàn)為多種生物學(xué)過程的紊亂，其中免疫系統(tǒng)過程、刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程貫穿整個(gè)燒傷早期，有研究顯示Myd88、Stat3、Stat1、Jun等基因在燒傷早期刺激反應(yīng)過程中起著重要的作用。為從分子水平了解燒傷后免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況的變化，并篩選出在其中占據(jù)重要位置的差異基因靶標(biāo)，

3、本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)小鼠燒傷早期免疫細(xì)胞差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選在燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過程中起到重要作用的潛在生物學(xué)靶標(biāo)，利用實(shí)時(shí)熒光PCR及Western blotting對(duì)所篩選的基因表達(dá)變化情況進(jìn)行驗(yàn)證，以期從分子水平了解燒傷后免疫功能變化情況，為臨床上燒傷早期診斷及治療靶點(diǎn)的篩選提供新方向。
　　研究目的：
　　利用生物信息學(xué)方法對(duì)小鼠燒傷早期免疫細(xì)胞差異基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選相關(guān)差異

4、基因，并對(duì)所篩選的基因表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，以期找到潛在的診斷及治療靶標(biāo)。
　　研究方法：
　　1.基因芯片數(shù)據(jù)處理及分析
　　從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE7404數(shù)據(jù)集。對(duì)燒傷后1天的樣本進(jìn)行分析，共8個(gè)樣本（小鼠，25％TBSAⅢ°燒傷，全血游離白細(xì)胞），其中4個(gè)為燒傷組，4個(gè)為對(duì)照組。
　　2.差異表達(dá)基因的獲取
　　差異基因的獲取及統(tǒng)計(jì)分析采用開源統(tǒng)計(jì)軟件R3.02版本(http://www.r-

5、project.org)進(jìn)行。采用RMA(robust multiarray average)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景矯正，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和倍比法(fold change，F(xiàn)C)獲取差異表達(dá)基因。
　　3.功能富集分析及免疫相關(guān)差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析
　　將差異基因經(jīng)DAVID進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換后輸入到STRING9.1數(shù)據(jù)庫中，選取中等可信度（交互作用評(píng)分大于0.4）的互作關(guān)系構(gòu)建免疫相關(guān)差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Prot

6、ein-protein interaction network，PPI），并對(duì)差異基因進(jìn)行GeneOntology(GO)功能富集分析，網(wǎng)絡(luò)分析及MCL子網(wǎng)絡(luò)聚類分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進(jìn)行。
　　4.免疫相關(guān)基因靶標(biāo)表達(dá)的檢測
　　選取32只健康成年BALB/c小鼠，體重20-22g，雌雄不限。隨機(jī)分為兩組，第一組為假燙傷組（sham組）、37度溫水。第二組為燙傷后1d組，小鼠用1％的戊巴比妥鈉（5

7、0mg/kg）腹腔麻醉后，背部備皮，將背部脫毛區(qū)域置于97℃熱水中燙傷15秒（建立三度燒傷模型），燙傷后立即腹腔注射生理鹽水抗休克處理。各組小鼠按分組的時(shí)間點(diǎn)行眼部取血，提取血液中的白細(xì)胞，然后提取mRNA及蛋白，實(shí)時(shí)熒光PCR及Western blotting檢測小鼠燒傷后白細(xì)胞中LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1的相對(duì)表達(dá)情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析:
　　采用開源統(tǒng)計(jì)軟件R3.02版本及SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件

8、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。原始數(shù)據(jù)進(jìn)行RMA背景矯正，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)和倍比法獲取差異表達(dá)基因，同時(shí)滿足p-value＜0.01以及|logFC|＞1，且表達(dá)量變化為2倍者為差異基因。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.基因芯片分析結(jié)果
　　共有1825個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因658個(gè)，下調(diào)基因1167個(gè)。
　　2.差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析
　　將差異基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)

9、絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共有1211個(gè)節(jié)點(diǎn)，5176條邊組成。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中位于中心位置的蛋白具有最大的互作關(guān)系，并且在疾病的進(jìn)展過程中可能發(fā)揮重要的作用。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作關(guān)系。運(yùn)用BinGo篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)緊密的模塊，發(fā)現(xiàn)LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1這5個(gè)基因在相應(yīng)的子網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置，并且在燒傷后早

10、期免疫過程發(fā)揮重要作用。
　　3.檢測小鼠燒傷早期免疫相關(guān)基因靶標(biāo)的表達(dá)
　　Jun和Cdk1燒傷后第1天mRNA表達(dá)量較sham組增加(P＜0.05)，其蛋白表達(dá)量較sham組明顯增加（P＜0.01）;Stat1燒傷后第1天mRNA表達(dá)量較sham組下降（P＜0.05），蛋白表達(dá)量較sham組明顯下降(P＜0.01)，這與芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。但LCK及CD19燒傷后第1天的表達(dá)量較sham組增加，與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

11、不一致，且與sham組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.小鼠燒傷后細(xì)胞存在免疫系統(tǒng)過程、應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)等方面的紊亂。
　　2.在免疫相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作關(guān)系。而LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1這5個(gè)基因在相應(yīng)的子網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置，可能在燒傷早期免疫系統(tǒng)功能變