新的候選抑癌基因DENND2D的鑒定與功能研究.pdf

1、目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人類健康。我們實(shí)驗(yàn)室利用以往構(gòu)建的肺癌差異表達(dá)基因EST文庫提供的信息，克隆了51個(gè)肺癌相關(guān)新基因。本研究的目的是鑒定新的肺癌相關(guān)抑癌基因，為肺癌提供新的早期診斷分子標(biāo)志物和治療標(biāo)靶，并為肺癌分子機(jī)理的研究提供新的基礎(chǔ)內(nèi)容。 本研究將候選基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，體外評(píng)估這些基因?qū)?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的促進(jìn)或抑制作用；利用RT-PCR的方法檢測(cè)目的基因在肺癌組織及其對(duì)照組織、肺癌細(xì)胞系和

2、永生化支氣管上皮細(xì)胞系、以及原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況；通過MTT法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，分析目的基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞系NCI-H1299增殖能力及非錨定性生長(zhǎng)能力的影響：通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察目的基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞系NCI-H1299致瘤能力的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因后對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響；通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)了解目的基因?qū)?xì)胞遷移性的影響；通過寡核苷酸微陣列技術(shù)檢測(cè)目的基因?qū)?xì)胞基因表達(dá)譜的影響

3、。 本研究從本實(shí)驗(yàn)室前期工作克隆的5個(gè)肺癌相關(guān)新基因之中，通過表型篩選得到一個(gè)能明顯抑制NIH/3T3細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化集落的候選抑癌基因DENND2D。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在27例肺鱗癌及其配對(duì)正常肺組織中，48．1％的腫瘤組織中DENND2D的表達(dá)水平下降甚至完全缺失：在9株肺癌細(xì)胞系和作為癌前病變模型的2株永生化的支氣管上皮細(xì)胞系中大部分表達(dá)缺失；但是在15例原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細(xì)胞中，此基因均有一定程度的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)顯

4、示，DENND2D基因穩(wěn)定過表達(dá)能明顯抑制NCI-H1299細(xì)胞的增殖速度，降低其平板集落形成數(shù)目，并減少軟瓊脂中集落形成的數(shù)目。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DENND2D基因穩(wěn)定過表達(dá)能顯著減弱NCI-H1299細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力，降低裸鼠成瘤率及所形成腫瘤的體積。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DENND2D基因主要是通過Gl/S期阻滯來發(fā)揮其抑制生長(zhǎng)的作用，而不是通過對(duì)凋亡的誘導(dǎo)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)顯示，DENND2D基因穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)

5、控因子p15、p16、p27、p21等基因均有不同程度的表達(dá)下調(diào)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)初步提示DENND2D基因能抑制H1299細(xì)胞的遷移能力，使劃痕愈合時(shí)間延長(zhǎng)。基因芯片結(jié)果提示DENND2D外源性過表達(dá)可對(duì)細(xì)胞周期，MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間黏附等重要的通路中的某些信號(hào)分子的表達(dá)產(chǎn)生影響，可在多方面對(duì)腫瘤的進(jìn)展產(chǎn)生作用。綜上所述，肺癌相關(guān)新基因DENND2D具有抑癌基因的特性，提示它是一個(gè)候選的抑癌基因。在癌前病變模型中已見DE