水稻OsCIPK基因家族的克隆與轉(zhuǎn)OsCBL8基因水稻的抗逆性分析.pdf

1、在植物細(xì)胞的逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ca2+作為第二信使具有非常重要的作用。當(dāng)植物細(xì)胞受到脅迫刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有時(shí)空特征的Ca2+信號(hào)，通過(guò)各種Ca2+傳感器蛋白識(shí)別和解碼，激活下游的級(jí)聯(lián)應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致許多逆境相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)。類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(CBL)家族是植物中特有的一類(lèi)鈣結(jié)合蛋白，CBL互作蛋白激酶(CIPK)家族是一類(lèi)依賴Ca2+的絲氨/酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有保守的類(lèi)SNF激酶結(jié)構(gòu)域和NAF基序。CBL/CIPK信號(hào)系統(tǒng)被

2、認(rèn)為在植物逆境應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。水稻(Oryza sativa L.)是單子葉植物中研究最廣泛的模式植物，也是世界上最重要的糧食作物，開(kāi)展水稻CBL及CIKP基因的研究，不僅有助于了解植物逆境脅迫下CBL/CIPK信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制，而且對(duì)水稻及其它作物的抗逆性遺傳改良也具有重要的指導(dǎo)作用。 本研究根據(jù)擬南芥AtCIPK基因家族的氨基酸序列，利用電子克隆的方法，從水稻中分離了12條編碼CIPK基因的全長(zhǎng)cDNA序列，比較

3、其基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)差異較大，其中OsCIPK3和OsCIPK24基因還存在兩種不同的可變剪接方式；氨基酸序列分析表明12個(gè)OsCIPK蛋白的序列同源性較高，氨基酸一致性在41.2～78.5％之間，所有OsCIPKs蛋白的N端都具有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，C端都合有與CBL蛋白互作必需的NAF基序，對(duì)水稻幼苗中OsCIPKs基因的表達(dá)特征及多種逆境處理下的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)高鹽、低鉀、ABA、

4、汞脅迫、低溫和白葉枯病菌等處理?xiàng)l件下，不同OsCIPK的表達(dá)特征明顯不同，其中OsCIPK2、10、11和14基因等4個(gè)基因在上述6種逆境處理下的表達(dá)量都明顯增加，推測(cè)這4個(gè)基因可能是逆境應(yīng)答途徑的上游調(diào)控因子，參與了多個(gè)抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。擬南芥AtCIPK24/SOS2已經(jīng)被證明是耐鹽SOS途徑中的關(guān)鍵因子，本研究為了證實(shí)水稻OsCIPK24在逆境中的功能，將該基因兩種可變剪接的ORF分別連接到pCAMBIA1304中，構(gòu)建了兩個(gè)過(guò)量

5、表達(dá)的雙元載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻日本晴愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)，獲得了抗性轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。目前，OsCIPK24轉(zhuǎn)基因植株的培育和功能檢測(cè)正在進(jìn)行之中。 對(duì)前期利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的OsCBL8過(guò)量表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系(T3代)進(jìn)行目標(biāo)基因的表達(dá)特征測(cè)定、農(nóng)藝性狀考察和高鹽、干旱和低溫等非生物逆境的耐逆性鑒定。半定量RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)正義基因顯著增強(qiáng)了植株中OsCBL8基因的表達(dá)量，而轉(zhuǎn)反義基因則對(duì)

6、內(nèi)源OsCBL8基因的表達(dá)具有一定的抑制作用；在田間生長(zhǎng)條件下，16個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、百粒重等與對(duì)照無(wú)顯著差異，但每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率顯著或極顯著低于對(duì)照，其中5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率極顯著低于對(duì)照。獲得一個(gè)耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)正義基因株系8F12，在150 mM NaCl處理10 d后，其幼苗根系K+/ Na+比顯著高于轉(zhuǎn)反義基因株系和對(duì)照，莖葉K+/ Na+比與轉(zhuǎn)反義基因株系和對(duì)照無(wú)顯著差異；篩選獲得一個(gè)