通過外源MYB基因的表達提高水稻的抗逆性.pdf

1、MYB基因家族是植物中數(shù)量最多的一類轉錄調控因子，R2R3-MYB基因是 MYB基因家族中最大的一個亞家族。R2R3-MYB基因不僅參與植物的發(fā)育及代謝過程，同時還在生物脅迫以及非生物脅迫耐性中發(fā)揮重要作用。AmROSEA1屬于R2R3-MYB蛋白，是調節(jié)金魚草花色素分布及密度的關鍵因子。AmRosea1之前被引入煙草、番茄、矮牽牛以及棉花等多個雙子葉物種中，并且顯著提高了轉基因植株花青素或其他次級代謝物的含量。
　　為了研究 A

2、mRosea1異位表達對于水稻生長發(fā)育的影響，我們將 AmRosea1轉入日本晴水稻，檢測了轉基因水稻中花青素以及類黃酮的含量，并進行了高鹽脅迫以及干旱脅迫實驗。我們發(fā)現(xiàn)，外源AmRosea1基因能夠顯著提高轉基因水稻對于高鹽脅迫以及干旱脅迫的耐性。我們對野生型水稻以及轉基因水稻在正常生長環(huán)境以及高鹽或干旱脅迫條件下的轉錄組進行了測序分析，發(fā)現(xiàn)一系列和脅迫相關的基因的轉錄水平受到了外源AmRosea1的影響。這些受影響的基因涉及脅迫信號

3、轉導、激素信號通路、離子平衡以及活性氧的清除。實驗結果如下：
　　1、獲得過量表達AmRosea1的轉基因水稻植株
　　我們構建了35S啟動子啟動AmRosea1過量表達的表達載體，并將其轉入水稻栽培品種日本晴中。利用AmRosea1特定的引物，對抗性苗進行PCR驗證，共有24棵PCR陽性植株。半定量實驗證明OXR20，OXR21和OXR22三個植株中AmRosea1的表達量較高。
　　2、測量花青素和總類黃酮的含量<

4、br>　　為檢測AmRosea1的過量表達對水稻花青素和總類黃酮積累量的影響，我們用分光光度法測量了成熟種子、三葉期以及抽穗期葉子中的含量，發(fā)現(xiàn) AmRosea1的過量表達并沒有影響轉基因水稻植株中花青素和總類黃酮的含量。
　　3、檢測轉基因植株對于高鹽和干旱脅迫的耐性
　　經干旱脅迫處理之后，OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為78％±5.6%,85%±8.2%和80%±7.1%，均高于WT植株20.8%±1.

5、7%的存活率；高鹽脅迫處理之后，OXR20、OXR21和OXR22的存活率分別為70%±5.9%、75%±5.6%和69%±4.3%，WT植株全部死亡。這些結果表明：過量表達AmROSEA1基因顯著提高了轉基因水稻植株對于干旱和高鹽脅迫的耐性。
　　4、轉錄組分析
　　為了研究轉基因株系脅迫耐性的分子機制，我們將OXR21作為轉基因株系的代表。取OXR21和WT在脅迫處理前以及脅迫處理不同時間點的葉片，進行轉錄組測序。

6、>　　篩選與脅迫響應相關的，在OXR21和WT之間差異表達的基因，結果如下：與WT相比，在PEG處理的0 h、6 h和24 h，OXR21中分別有64、282和50個干旱脅迫響應基因表達上調，49、240和33個干旱脅迫響應基因表達下調；在鹽處理的0 h、1 h和6 h， OXR21中分別有49、197和58個鹽脅迫響應基因表達上調，34、266和26個鹽脅迫響應基因表達下調。
　　對差異表達基因的venn分析表明：分別有8個和1

7、2個基因在PEG處理的0 h、6 h、24h三個時間點和鹽處理的0h、1h、6h三個時間點的表達都上調；分別有20個基因在PEG處理的6 h、24 h和鹽處理的1 h、6 h的表達上調；分別有15和26個基因在PEG處理的24 h和鹽處理的6 h的表達上調。
　　對差異表達基因的GO富集分析表明，在“生物學過程”這一類別里，干旱脅迫和鹽脅迫的差異基因分別富集到6個GO term里，其中有4個是相同，它們是“對內源性刺激響應”“對非

8、生物刺激響應”“對脅迫響應”和“對刺激響應”。KEGG分析表明，無論是在干旱脅迫條件下還是在鹽脅迫條件下，與WT植株相比，轉基因植株中的茉莉酸信號通路均被促進，而乙烯信號通路均被抑制。
　　差異表達的基因里包含有鉀離子高親和運輸?shù)鞍?、果糖基轉移酶等與滲透保護相關的蛋白的編碼基因，以及過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等與氧化脅迫相關的蛋白的編碼基因。另外，RD22、熱激蛋白、LEA蛋白和 RAB16A，

9、這些脅迫響應蛋白；轉錄因子DREB1F、MYB48和NAC134；信號轉導分子，絲氨酸-蘇氨酸激酶、CIPK14、 CIPK15的編碼基因的轉錄水平，在WT和轉基因植株之間也表現(xiàn)出差異。另外，還有一些不知功能的基因的表達被改變。
　　總之,AmROSEA1在水稻中過量表達通過直接或間接地改變一系列基因的表達水平，使得轉基因水稻植株獲得了較WT高的鹽脅迫耐性和干旱脅迫耐性。
　　被子植物的胚乳由受精極核發(fā)育而來，為胚胎的發(fā)育提

10、供一些信號。胚乳在種子發(fā)育的早期，為胚胎提供營養(yǎng)；在有永久胚乳的種子中，胚乳還為萌發(fā)時的幼苗提供營養(yǎng)。谷類種子的胚乳不僅是地球上人類和牲畜最重要的糧食資源，同時能為加工商品和生物燃料提供原材料。因此，研究胚乳的發(fā)育不僅具有重要的理論意義，還能產生經濟效益。
　　大多數(shù)被子植物的胚乳發(fā)育類型為核型，發(fā)育過程經歷：合胞體期，細胞化，內層淀粉胚乳和外層糊粉層胚乳的分化以及細胞的程序化死亡。目前，對于胚乳早期發(fā)育的研究已經有了很大進展，但

11、對于胚乳細胞死亡過程的研究仍十分有限。AtZOU基因編碼的bHLH轉錄因子是調節(jié)擬南芥胚乳程序化細胞死亡的重要因子。
　　作為重要糧食作物和單子葉模式植物的水稻，其種子中保留有永久性的淀粉胚乳。為研究水稻中ZOU同源基因在水稻胚乳發(fā)育以及胚胎發(fā)育中的功能，更好地認識水稻胚乳降解的調控機制，我們克隆了水稻中ZOU的同源基因，進行了基因表達分析，功能互補試驗，構建了GUS報告載體、正義表達載體、反義表達載體并轉化水稻。實驗結果表明：<

12、br>　　1、水稻ZOU基因的進化與表達分析
　　通過序列比對和進化分析，我們發(fā)現(xiàn)水稻中存在兩個ZOU同源基因：LOC_Os04g35010(OsZOU-1)和 LOC_Os02g34320(OsZOU-2)。通過實時熒光定量PCR檢測它們在營養(yǎng)生長期水稻的根、莖、葉、拔節(jié)孕穗期的小花、花后2天、5天、7天以及9天的種子中的表達水平。發(fā)現(xiàn)OsZOU-1在營養(yǎng)器官以及受精前的種子中表達量極低，在DAP2的種子中輕微表達，DAP5時表

13、達量很高，之后降低。OsZOU-2主要在莖和葉中表達，在種子中表達量極低。
　　2、OsZOU-1基因互補擬南芥zou-4突變體表型
　　轉化 AtZOUpromoter::OsZOU-1的擬南芥zou-4突變體的表型得到部分回復；轉化AtZOUpromoter::OsZOU-2未能改變zou-4突變體的表型。
　　3、通過GUS染色檢測OsZOU-1在種子中的表達模式
　　用報告載體 OsZOU-1promot

14、er::GUS轉化水稻，我們發(fā)現(xiàn)，在受精后3天的種子上沒有GUS信號；受精后5天的種子整個胚乳區(qū)都有GUS信號；之后GUS信號的范圍逐漸縮小至種子的背部區(qū)域。
　　4、OsZOU-1組成性表達水稻植株的表型
　　用組成性過量表達的載體Ubipromoter:: OsZOU-1轉化水稻，轉化株系表現(xiàn)出與AtZOU組成性過表的擬南芥株系（zou-1D）相似的表型：植株矮小，葉片窄且沿葉邊緣向上卷曲，育性降低。另外我們還發(fā)現(xiàn)：組成

15、性過表株系的穎殼細胞變小導致穎殼變窄進而導致種子窄；淀粉胚乳積累不充分，不能完全充滿整個果皮。
　　5、OsZOU-1表達沉默的水稻植株的表型
　　用反義載體 ZOUpromoter:: OsZOU-1anti-sense轉化水稻植株，轉基因種子未能正常進行PCD，胚胎同胚乳粘連在一起；沉默株系種子的生長停滯在大約受精后第8天；淀粉積累明顯較WT少。上述結果證明:OsZOU-1在水稻胚乳發(fā)育中起到了調控水稻胚乳程序性細胞死亡

16、的作用。OsZOU-1過量表達以及 OsZOU-1表達沉默的種子中，淀粉積累均不足，我們推測胚乳程序性細胞死亡影響淀粉的積累。
　　本研究的創(chuàng)新點：
　　本研究首次將 AmRosea1基因導入到水稻(Oryza sativa L.)中。異位表達的AmROSEA1通過直接或間接地調節(jié)不同基因的表達，提高了轉基因水稻對高鹽和干旱脅迫的耐受，這為利用該基因提高其他水稻品種的非生物脅迫耐受提供了一條可能的途徑。
　　本研究首次