應用大塊平鋪法對人臍帶間充質干細胞分離、傳代、凍存及復蘇的研究.pdf

1、目的:應用四種不同的培養(yǎng)方法進行人臍帶間充質干細胞的分離、傳代、凍存、復蘇，比較各方法之間優(yōu)劣，探索并建立一種簡單、實用的人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)方法，為再生醫(yī)學以及實驗研究提供新的培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的方法。
　　 方法:分別以1大塊平鋪法;2傳統(tǒng)組織塊法;3膠原酶Ⅳ消化法;4.膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法，四種不同的方法對臍帶間充質干細胞進行細胞分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇。鏡下觀察細胞形態(tài)，記錄各組細胞首次融合時間、各組

2、成功率，并以臺盼藍染色法測定細胞活性，以第3代細胞應用流式細胞術鑒定細胞免疫表型。
　　 結果:1細胞形態(tài):鏡下可見貼壁細胞呈長梭形，無序生長，可呈渦旋狀生長。2免疫表型鑒定:應用流式細胞術對大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞進行免疫表型鑒定。結果顯示:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達。3統(tǒng)計結果分析（由于膠原酶Ⅳ消化法無一

3、例成功，則不做分析）。3.1首次融合時間:大塊平鋪法(17.81±0.85d)明顯早于傳統(tǒng)組織塊法(24.89±0.97d)，差異有顯著性(p＜0.05)，但明顯晚于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(7.35±0.61d)，差異有顯著性(p＜0.05)。3.2穩(wěn)定傳代:大塊平鋪法(11.08±0.74代)與傳統(tǒng)組織塊法(11.04±0.77代)無明顯差別，差異無顯著性(p＞0.05)，但明顯長于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(6.82±0.6

4、4代)，差異有顯著性(p＜0.05)。3.3細胞活性:大塊平鋪法(90.84±0.83％)與傳統(tǒng)組織塊法(90.67±0.88％)無明顯差別，不具有統(tǒng)計學意義(p＞0.05），但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法(75.06±0.90％)，有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。3.4成功率:大塊平鋪法與傳統(tǒng)組織塊法差異無顯著性(p＞0.0167)，但明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法，差異有顯著性(p＜0.0167)。
　　 結論:

5、1臍帶華通膠組織是人間充質干細胞的重要來源。2應用大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法三種方法可成功培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，而應用膠原酶Ⅳ消化法則很難成功培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞，原因在于華通膠組織中含有大量的透明質酸，單用膠原酶Ⅳ很難消化完全，需添加透明質酸酶聯(lián)合消化方可行。3鏡下可見人臍帶間充質干細胞呈長梭形貼壁生長，可呈無序生長，呈渦旋狀生長。4大塊平鋪法、傳統(tǒng)組織塊法以及膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法培養(yǎng)的人臍帶

6、間充質干細胞均可穩(wěn)定傳代、凍存、復蘇，復蘇后細胞增殖穩(wěn)定。5大塊平鋪法實驗操作上省去了剪碎以及鋪塊等最為繁瑣的過程，比傳統(tǒng)組織塊法更為簡便，而以往研究表明，酶消化法操作繁瑣，不如傳統(tǒng)組織塊法簡單。膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法是酶消化法的一種，同樣操作繁瑣，大塊平鋪法操作明顯較膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法簡單，且原代培養(yǎng)獲得MSCs的時間要短于傳統(tǒng)組織塊法，提高了獲得人臍帶間充質干細胞的效率;以往研究表明，傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)的人臍帶間充質干

7、細胞細胞活性要優(yōu)于酶消化法，而大塊平鋪法細胞活性與傳統(tǒng)組織塊法無差別，明顯優(yōu)于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法;大塊平鋪法培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞的成功率與傳統(tǒng)組織塊法無差別，且明顯高于膠原酶Ⅳ聯(lián)合透明質酸酶消化法。6應用流式細胞術檢測大塊平鋪法培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞免疫表型表明:CD13、CD44、CD29、CD90、CD73、CD105均為陽性表達，CD14、CD31、CD45、CD34、HLA-DR均為陰性表達，符合間充質干細胞的免疫