大鼠腹主動脈二次深低溫凍存的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：比較動脈一次和二次深低溫凍存后形態(tài)學(xué)與生物學(xué)活性差異；初步探討二次深低溫凍存動脈的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：雄性Wistar大鼠84只，體重190～210克，6～7周齡，其中60只隨機(jī)分為3組(每組供受體各半)：對照組(normal group，n=20)，取腹主動脈，長約9～12mm，在手術(shù)顯微鏡下行同種異體新鮮腹主動脈原位移植術(shù)，術(shù)后縫合腹壁并保溫24小時(shí)，常規(guī)喂養(yǎng)；一次凍存組(control group，n=20)

2、，取腹主動脈，長約9～12mm，修整后依次放入含2.5％、5％、7.5％二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640液中平衡15分鐘，最后放入含10％DMSO和20％胎牛血清的RPMI1640液中，程序降溫儀以1℃/min的降溫速率降溫至-80℃，再以5℃/min降溫速率降溫至-130℃，放入液氮保存，2周后復(fù)溫，行同種異體原位腹主動脈移植術(shù)，術(shù)后縫合腹壁并保溫24小時(shí)，常規(guī)喂養(yǎng)；二次凍存組(test group，n=20)，取腹主動脈，長

3、約9～12mm，以次凍存2周后復(fù)溫，室溫下放置1小時(shí)候再次凍存，液氮中保存2周后復(fù)溫，行同種異體原位腹主動脈移植術(shù)，術(shù)后縫合腹壁并保溫24小時(shí)，常規(guī)喂養(yǎng)；3組大鼠在術(shù)后5周行順行腹主動脈造影，造影后處死，取移植段動脈，觀察內(nèi)膜是否光滑，有無動脈瘤形成等。另取24只大鼠，取腹主動脈，隨機(jī)分為3組：對照組(n=8)，一次凍存組(n=8)和二次凍存組(n=8)，將每個(gè)血管標(biāo)本切取2段長約3mm的血管環(huán)，其中一段應(yīng)用器官浴槽系統(tǒng)測試其內(nèi)皮細(xì)胞和

4、平滑肌細(xì)胞活性，另一段應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)染色結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析評價(jià)細(xì)胞存活率；每組隨機(jī)抽取樣本行掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡檢查，了解內(nèi)皮細(xì)胞層完整性、細(xì)胞形態(tài)，以及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的超微變化，各血管常規(guī)行病理切片HE染色和地衣紅染色，觀察管壁結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：⑴病理切片HE染色顯示新鮮動脈內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，與內(nèi)皮下層連接緊密，管壁彈力層、平滑肌細(xì)胞層排列致密、規(guī)則；一次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，可見內(nèi)皮細(xì)胞缺失或與

5、內(nèi)皮下層脫離，動脈壁各層排列較松散；二次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞層不連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞缺失較一次凍存動脈嚴(yán)重，動脈壁各層排列較松散，與一次凍存動脈無顯著差別。地衣紅染色顯示新鮮動脈彈力層致密，波浪狀走形；一次凍存動脈和二次凍存動脈彈力層疏松，并可見薄弱、斷裂區(qū)域。⑵透射電子顯微鏡顯示新鮮動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)正常，細(xì)胞器完整，胞漿均勻，內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮下層附著緊密，內(nèi)彈力層致密均勻；一次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器破壞，細(xì)胞

6、萎縮，內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮下基質(zhì)間隙增大，平滑肌細(xì)胞胞漿均勻，胞核完整，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器腫脹，可見斷裂彈力纖維，但結(jié)構(gòu)尚致密，二次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器破壞，細(xì)胞萎縮，內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮下層脫離，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細(xì)胞胞漿減少，染色質(zhì)邊集，胞膜模糊不清，結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞器消失，彈力纖維疏松，斷裂較多。⑶掃描電子顯微鏡觀察新鮮血管移植后內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，走形一致，胞漿飽滿；一次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞塌陷，可見細(xì)胞核輪廓，細(xì)胞間可見網(wǎng)

7、狀裂隙，內(nèi)皮下基質(zhì)暴露：二次凍存動脈內(nèi)皮細(xì)胞呈網(wǎng)狀，廣泛內(nèi)皮下基質(zhì)暴露。⑷器官浴槽法測試血管細(xì)胞活性顯示：新鮮動脈對于KCL、PE、Ach等血管活性藥物反應(yīng)強(qiáng)烈，一次凍存動脈對于血管活性藥物反應(yīng)明顯下降(P<0.05)，二次凍存動脈對于血管活性藥物的反應(yīng)與一次凍存動脈相比顯著降低(P<0.05)；計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)合MTT染色結(jié)果顯示：二次凍存動脈和一次凍存動脈相比，存活細(xì)胞比例無顯著差異(P>0.05)。⑸動脈造影結(jié)果顯示：新鮮動脈移植

8、組除一例出現(xiàn)動脈吻合口狹窄外，其余均通暢，無動脈瘤和血栓形成，吻合口無漏血，一次和二次凍存動脈移植組造影通暢，無狹窄、出血、血栓和動脈瘤形成；手術(shù)顯微鏡下觀察移植血管內(nèi)皮光滑，吻合口處內(nèi)皮連續(xù)無血栓，未見動脈擴(kuò)張及動脈瘤形成；
　　 結(jié)論：①深低溫凍存動脈生物學(xué)活性的降低是基于低溫對于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷；②深低溫凍存動脈管徑增大、彈性下降是基于低溫對于動脈彈力纖維層的破壞；③二次深低溫凍存大動脈能夠滿足動脈移植的