胎盤和臍帶來源組織與細胞的分離、培養(yǎng)及凍存.pdf

1、背景：近年來，國內(nèi)外已經(jīng)認識到成體干細胞可以作為細胞治療、基因治療以及組織工程的種子細胞。本研究探討胎盤和臍帶來源的組織與細胞包括胎盤組織中貼壁細胞(human placental derived adherent cells，HPDACs)和臍動脈平滑肌細胞(human umbilical artery smooth muscle cells，HUA-SMCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定及胎盤組織的低溫凍存，為將來實現(xiàn)個體化的基因治療及細胞治

2、療提供豐富的細胞和組織資源儲備。 第一部分 目的：比較人胎盤組織的不同凍存方法、分析凍存對胎盤組織中HPDAC分離效率的影響及對HPDAC進行生物學(xué)特性分析。 方法：將新鮮胎盤組織分為五組，每組20g，用攪拌機攪碎成3mm×3mm大小的組織塊，分為5管，五組分別以不同濃度(5％、10％、20％、40％、60％)的玻璃化冷凍保護劑(preservation and vitrification solution，PV

3、S<,2>)作為抗凍劑，快速降溫，置液氮中保存。凍存3個月后將該凍存組織復(fù)蘇，對凍存前后的胎盤組織分別進行鈉鉀-ATP酶、過氧化氫酶的活力以及HPDAC的分離效率檢測(組織塊消化貼壁法培養(yǎng)30天獲取的HPDAC細胞數(shù)/胎盤組織重量)。同時對上述分離的}~PDAC進行形態(tài)學(xué)觀察、免疫表型鑒定、生長曲線的測定以及向成骨、成脂的誘導(dǎo)分化。 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)10％PVS<,2>組的酶學(xué)活性最高，其次是20％PVS<,2>組，最低的是60％PV

4、S<,2>組；新鮮胎盤組織的HPDAC平均分離效率為：(0.575+0.30)×10<'5>個/g，凍存后胎盤組織僅有10％PVS<,2>組能分離出HPDAC，其HPDAC平均分離效率為(0.158±0.05)×10<'5>個/g；凍存復(fù)蘇胎盤組織來源的HPDAC形態(tài)學(xué)、免疫表型以及生長曲線與新鮮胎盤組織來源的HPDAC基本一致。 第二部分目的：從人臍動脈中分離HUA-SMC并探索深低溫保存對其生物學(xué)特性的影響。 方法：

5、取人臍動脈血管中膜組織塊采用貼壁法分離原代XUA-SMC，用二步法深低溫保存HUA-SMC。凍存3個月后復(fù)蘇，比較凍存前后HUA-SMC的細胞形態(tài)，利用抗a-smooth muscle actin抗體進行免疫細胞化學(xué)鑒定和生長曲線等生物學(xué)特性分析。 結(jié)果：顯示組織塊貼壁法可獲得大量的梭形HUA-SMC，抗 a-smooth muscle actin抗體免疫組化鑒定為陽性，凍存前后HUA-SMC在細胞形態(tài)、生物學(xué)特性上無明顯差異。

6、 結(jié)論 (1)本研究成功地從胎盤組織中分離得到HPDAC，具有干細胞的特征，具有向骨組織和脂肪組織分化的潛能。 (2)本研究發(fā)現(xiàn)胎盤組織凍存復(fù)蘇后，HPDAC的分離效率較低，低溫凍存對胎盤組織的存活影響較大。 (3)本研究成功地從人臍動脈中分離得到HUA-SMC，該細胞凍存后可以長期保存并且凍存復(fù)蘇后的HUA-SMC保留了HUA-SMC的基本生物學(xué)特征，能保持較強的增殖能力并連續(xù)傳代。將來可以為組織工程的