胎盤(pán)和臍帶來(lái)源組織與細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及凍存.pdf

1、背景：近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)認(rèn)識(shí)到成體干細(xì)胞可以作為細(xì)胞治療、基因治療以及組織工程的種子細(xì)胞。本研究探討胎盤(pán)和臍帶來(lái)源的組織與細(xì)胞包括胎盤(pán)組織中貼壁細(xì)胞(human placental derived adherent cells，HPDACs)和臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical artery smooth muscle cells，HUA-SMCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定及胎盤(pán)組織的低溫凍存，為將來(lái)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化的基因治療及細(xì)胞治

2、療提供豐富的細(xì)胞和組織資源儲(chǔ)備。 第一部分 目的：比較人胎盤(pán)組織的不同凍存方法、分析凍存對(duì)胎盤(pán)組織中HPDAC分離效率的影響及對(duì)HPDAC進(jìn)行生物學(xué)特性分析。 方法：將新鮮胎盤(pán)組織分為五組，每組20g，用攪拌機(jī)攪碎成3mm×3mm大小的組織塊，分為5管，五組分別以不同濃度(5％、10％、20％、40％、60％)的玻璃化冷凍保護(hù)劑(preservation and vitrification solution，PV

3、S<,2>)作為抗凍劑，快速降溫，置液氮中保存。凍存3個(gè)月后將該凍存組織復(fù)蘇，對(duì)凍存前后的胎盤(pán)組織分別進(jìn)行鈉鉀-ATP酶、過(guò)氧化氫酶的活力以及HPDAC的分離效率檢測(cè)(組織塊消化貼壁法培養(yǎng)30天獲取的HPDAC細(xì)胞數(shù)/胎盤(pán)組織重量)。同時(shí)對(duì)上述分離的}~PDAC進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫表型鑒定、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定以及向成骨、成脂的誘導(dǎo)分化。 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)10％PVS<,2>組的酶學(xué)活性最高，其次是20％PVS<,2>組，最低的是60％PV

4、S<,2>組；新鮮胎盤(pán)組織的HPDAC平均分離效率為：(0.575+0.30)×10<'5>個(gè)/g，凍存后胎盤(pán)組織僅有10％PVS<,2>組能分離出HPDAC，其HPDAC平均分離效率為(0.158±0.05)×10<'5>個(gè)/g；凍存復(fù)蘇胎盤(pán)組織來(lái)源的HPDAC形態(tài)學(xué)、免疫表型以及生長(zhǎng)曲線與新鮮胎盤(pán)組織來(lái)源的HPDAC基本一致。 第二部分目的：從人臍動(dòng)脈中分離HUA-SMC并探索深低溫保存對(duì)其生物學(xué)特性的影響。 方法：

5、取人臍動(dòng)脈血管中膜組織塊采用貼壁法分離原代XUA-SMC，用二步法深低溫保存HUA-SMC。凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，比較凍存前后HUA-SMC的細(xì)胞形態(tài)，利用抗a-smooth muscle actin抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定和生長(zhǎng)曲線等生物學(xué)特性分析。 結(jié)果：顯示組織塊貼壁法可獲得大量的梭形HUA-SMC，抗 a-smooth muscle actin抗體免疫組化鑒定為陽(yáng)性，凍存前后HUA-SMC在細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)特性上無(wú)明顯差異。

6、 結(jié)論 (1)本研究成功地從胎盤(pán)組織中分離得到HPDAC，具有干細(xì)胞的特征，具有向骨組織和脂肪組織分化的潛能。 (2)本研究發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織凍存復(fù)蘇后，HPDAC的分離效率較低，低溫凍存對(duì)胎盤(pán)組織的存活影響較大。 (3)本研究成功地從人臍動(dòng)脈中分離得到HUA-SMC，該細(xì)胞凍存后可以長(zhǎng)期保存并且凍存復(fù)蘇后的HUA-SMC保留了HUA-SMC的基本生物學(xué)特征，能保持較強(qiáng)的增殖能力并連續(xù)傳代。將來(lái)可以為組織工程的