大鼠胰島β細(xì)胞分離與培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、目的:探索胰島β細(xì)胞分離純化的方法，尋找大鼠胰島β細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的適宜條件。 方法:選用正常喂養(yǎng)的Wistar大鼠(雌雄不限，7-8周齡，體重250-300克)，采用經(jīng)膽總管插管注入膠原酶的方法對大鼠胰腺進(jìn)行消化，然后分別以20目和80目的不銹鋼網(wǎng)篩過濾初步純化胰島，雙硫腙染色及葡萄糖刺激試驗(yàn)鑒定胰島及其活性。分離純化后的胰島在RPMI-1640培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后的胰島經(jīng)洗滌沉降等處理后，以胰蛋白酶和DNA酶再次消化，形

2、成胰島的單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液置于2.8mmol/L葡萄糖液，用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria)以100mw，488nm的激光照射，分選510nm～550nm處的細(xì)胞。用免疫組織化學(xué)染色法及不同濃度葡萄糖刺激試驗(yàn)鑒定分選細(xì)胞及其活性，將所分選β細(xì)胞置于不同葡萄糖和IBMX.濃度的Ham’s F-10培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察IBMX對β細(xì)胞活性的影響。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)大鼠胰腺經(jīng)過膠原酶消化和初步純化后，平均每只大鼠可獲得550±95個

3、胰島，DTZ染色及葡萄糖刺激試驗(yàn)證明胰島活性良好。進(jìn)行：FACS后，平均每只大鼠可得到約5688個β細(xì)胞，回收率為93.69％，分離純度為85.5％。將β細(xì)胞置于不同濃度葡萄糖和IBMX的：Ham’sF-10培養(yǎng)基中，在較高濃度葡萄糖條件下(10.0mmol/L，及16.0mmol/L)，β細(xì)胞活性較高，死亡和凋亡也較少。未觀察到IBMX對β細(xì)胞活性的影響。 結(jié)論: 1、從正常喂養(yǎng)的健康大鼠分離純化所得的胰島經(jīng)過胰蛋白酶