胚胎干細胞的凍存復(fù)蘇及其自發(fā)分化培養(yǎng)時上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的研究.pdf

1、研究目的:
　　 對人胚胎干細胞進行凍存和復(fù)蘇，比較-80℃凍存法、常規(guī)液氮凍存法和玻璃化凍存法對人胚胎干細胞冷凍保存的效率，以及復(fù)蘇后細胞生長與分化的狀態(tài)，建立高效的凍存方法。通過觀察和檢測人胚胎干細胞在自發(fā)分化培養(yǎng)條件下的細胞分化情況，探討人胚胎干細胞自發(fā)分化培養(yǎng)時的分化規(guī)律。
　　 研究方法:
　　 1、將人胚胎干細胞進行-80℃凍存法凍存、常規(guī)液氮凍存法凍存及玻璃化凍存法法凍存，并在其凍存5d和60d時復(fù)

2、蘇。
　　 2、對復(fù)蘇的人胚胎干細胞進行堿性磷酸酶染色，RT-RCR分析復(fù)蘇人胚胎干細胞的Oct-4、nanog、E-cadherin和Vimentin基因的表達情況。
　　 3、觀察自發(fā)分化培養(yǎng)條件下的人胚胎干細胞化學(xué)染色特性，免疫熒光染色檢測自發(fā)分化培養(yǎng)的人胚胎干細胞上皮細胞標(biāo)志(E-cadherin、CD24)和間質(zhì)干細胞標(biāo)志(Vimentin、CD44)的表達情況。
　　 4、實時熒光定量PCR鑒定自發(fā)分

3、化培養(yǎng)的人胚胎干細胞上皮細胞相關(guān)基因(E-cadherin、ZO-1)和間質(zhì)干細胞相關(guān)基因(N-cadherin、Vimentin、Fibronectin)的表達情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、不同凍存方法及凍存時間復(fù)蘇后人胚胎干細胞回收率:-80℃凍存組、常規(guī)液氮凍存組、玻璃化凍存組在5d時的回收率分別為28.5％、28.3％和80％，組間比較-80℃組與常規(guī)液氮組差異無顯著性意義(P＞0.05)，其余組間比較差異

4、有顯著性意義(P＜0.01)。在60d時回收率分別為7.1％、25％和73.3％，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.01)。-80℃凍存法在凍存5d和60d差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 2、不同凍存方法及凍存時間復(fù)蘇后人胚胎干細胞存活率:-80℃凍存組、常規(guī)液氮凍存組、玻璃化凍存組在5d時的復(fù)蘇后存活率分別為8.5％、11.6％和70％，組間比較-80℃組與常規(guī)液氮組差異無顯著性意義(P＞0.05)，其余組間比較差異有

5、顯著性意義(P＜0.01)。在60d時復(fù)蘇后存活率分別為0％、8.3％和66.7％，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.01)。-80℃凍存法在凍存5d和60d差異有顯著意義(P＜0.05)，其余組在不同凍存時間比較差異無顯著意義(P＞0.05)。
　　 3、不同凍存方法及凍存時間復(fù)蘇后人胚胎干細胞克隆分化程度:-80℃凍存組、常規(guī)液氮凍存組、玻璃化凍存組在5d和60d復(fù)蘇后未分化率分別為有升高的趨勢。
　　 4、不同凍存

6、方法及凍存時間復(fù)蘇后人胚胎干細胞生物學(xué)特征鑒定:常規(guī)液氮凍存組、玻璃化凍存組復(fù)蘇后第6代人胚胎干細胞ALP表達陽性，通過RT-PCR檢測Oct-4、nanog、E-cadherin和Vimentin基因的表達情況與未凍存組比較無明顯差異。
　　 5、人胚胎干細胞自發(fā)分化培養(yǎng):人胚胎干細胞自發(fā)分化培養(yǎng)早期，通過鏡下觀察到胚胎干細胞邊緣開始呈上皮樣細胞分化，然后上皮樣細胞分化為間質(zhì)干樣細胞。無飼養(yǎng)層人胚胎干細胞自發(fā)分化細胞團塊呈現(xiàn)中

7、心向邊緣的ALP和PAS染色陽性逐漸減弱的趨勢。免疫熒光結(jié)果顯示上皮樣細胞向間質(zhì)干樣細胞分化過程中，CD24表達從陽性逐漸表達減弱，甚至陰性，CD44表達由陰性逐漸呈陽性。人胚胎干細胞自發(fā)分化的上皮樣細胞E-cadherin、ZO-1表達量明顯高于間質(zhì)干樣細胞，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin在上皮樣細胞表達明顯低于間質(zhì)干樣細胞。
　　 6、人胚胎干細胞自發(fā)分化傳代細胞:P1代上皮樣細胞的E-ca

8、dherin和Vimentin免疫熒光染色都呈陽性;P2代不規(guī)則細胞的E-cadherin陽性明顯開始減弱，Vimentin的表達增強;P4代細胞E-cadherin陰性，Vimentin強陽性。隨著傳代次數(shù)增加，E-cadherin、ZO-1表達量呈先上升后下降的趨勢，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin表達量呈上升趨勢，Oct-4的表達量總體呈下降趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 1、玻璃化凍存