Th17細胞的分化以及雷公藤甲素對其分化作用的體內和體外研究.pdf

1、傳統(tǒng)上，人們按照CD4+T細胞分化和功能、特征將其分為Th1細胞和Th2細胞。然而最近研究發(fā)現(xiàn)一群新的T細胞亞群，被稱為Th17細胞，從而打破了T細胞傳統(tǒng)的兩分法觀點。Th17細胞以分泌IL-17(IL-17A)為特征，此外還可以分泌IL-17F，TNF-α，IL-6和IL-22。 Th17細胞是一群獨立的T細胞亞群，不依賴于Th1和Th2分化相關的關鍵細胞因子和信號轉導分子。起初認為IL-23在自身抗原特異性的T細胞產(chǎn)生IL-

2、17的過程中發(fā)揮著重要的作用。然而，最近一些研究表明IL-23不參與Th17細胞的早期分化，但是對擴增和維持產(chǎn)生IL-17的細胞方面起重要作用。IL-6和TGF-β才是Th17細胞分化所必需的細胞因子。此外研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β存在的條件下，Toil樣受體的配體，如LPS，CpG，PolyI:C也可以誘導IL-17的產(chǎn)生。在第一章的實驗中，我們觀察到IL-23可以誘導小鼠脾細胞中IL-17的產(chǎn)生。加入TGF-β和LPS或CpG可以進一步促

3、進脾細胞中IL-17和IL-17+CD4+T細胞的產(chǎn)生。但是IL-23幾乎不能誘導純化的CD4+T細胞中IL-17的產(chǎn)生。IL-6+TGF-β的共同存在才能使純化的CD4+T細胞分化為Th17細胞。此外，我們觀察到IL-6+TGF-β誘導Th17細胞分化的同時，還誘導產(chǎn)生出兩群細胞，IL-2+CD4+T細胞和IL-17+IL-2+CD4+T細胞。因此，我們推測IL-17和IL-2在分化過程中可能存在交叉途徑。 眾所周知，以不同遺

4、傳背景的小鼠在感染相同的細菌、病毒或是接受相同的刺激后，可以表現(xiàn)出不同的免疫應答。在第一章實驗中，我們比較了不同遺傳背景的C57BL/6鼠和BALB/c鼠中分離出脾細胞在相同的刺激條件下，IL-17的產(chǎn)生和Th17細胞的分化是不同的。研究發(fā)現(xiàn)無論是在IL-23、LPS、TGF-β刺激條件下還是在IL-6+TGF-β的刺激條件下，C57BL/6鼠的脾細胞分泌IL-17的量均明顯高于BALB/c鼠的脾細胞分泌IL-17的量。然而從這兩種鼠的

5、脾細胞中分離出的CD4+T細胞經(jīng)相同誘導IL-17產(chǎn)生的刺激劑刺激培養(yǎng)后，IL-17的分泌量無顯著性差異。 自身免疫性疾病是機體對自身成分發(fā)生免疫應答而導致的疾病狀態(tài)，以前被認為與Th1免疫應答密切相關。然而最近研究發(fā)現(xiàn)，IL-17基因缺陷鼠抵抗實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)的發(fā)生與發(fā)展。并且在多種人類自身免疫性疾病的受累關節(jié)中檢測到高表達的IL-17。因此，現(xiàn)在認為Th17在自身免疫性疾病中發(fā)揮

6、著重要的作用。 傳統(tǒng)中藥雷公藤因其獨特的抗炎、免疫調節(jié)作用被廣泛應用于自身免疫性疾病。雷公藤甲素(triptolide，Trip)是一種從雷公藤(Tripterygiumwilfordiihookf，TWHF)中純化出來二萜類化合物，是雷公藤的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，Trip的這些作用與影響多種細胞因子的分泌有關，例如可以抑制Th1型細胞因子的產(chǎn)生，不影響Th2型細胞因子的產(chǎn)生。但是未見有關Trip影響IL-17產(chǎn)生以及Th17

7、細胞分化方面的報道。因此我們首先在第二章中研究了體外Trip對Th17細胞分化的影響。結果顯示。Trip可以劑量依賴性的抑制IL-6和TGF-β誘導C57BL/6鼠的脾細胞產(chǎn)生的IL-17。當我們將Trip從初次培養(yǎng)(即經(jīng)IL-6+TGF-β培養(yǎng))后的細胞中洗去，在低濃度IL-2休息3天，經(jīng)PMA和Ionomycin二次刺激后，在初次培養(yǎng)中加入Tip的細胞組中IL-17的產(chǎn)生仍然被抑制。在純化的CD4+T細胞中也得到了相似的結果。這些結

8、果說明Trip在體外可以直接有效的抑制Th17細胞的分化。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Trip后可以明顯抑制IL-17mRNA的表達。因此，我們認為Trip從蛋白水平和mRNA水平上抑制了IL-17的產(chǎn)生。 Th17細胞是一類新的Th細胞亞群，在其分化過程中不需要Th1或Th2分化所需的轉錄因子(如，T-bet、STAT1、STAT6等)，而是需要STAT3的參與。IL-6也是是通過STAT3活化所需的gp130上的酪氨酸殘基直接作用于T細

9、胞，從而促進Th17細胞的分化。 在第二章實驗中，我們觀察到Trip可以抑制IL-6在純化的CD4+T細胞中誘導的STAT3磷酸化。我們推測，Trip對Th17細胞分化的抑制作用與抑制IL-6誘導的STAT3磷酸化之間存在著一定的相關性。 為了進一步確認Trip對Th17細胞分化的抑制作用，我們在C57BL/6鼠中構建了CIA模型。與文獻報道相似，我們構建的模型中小鼠的發(fā)病率約為55％。在第三章實驗中，我們發(fā)現(xiàn)CIA和C

10、IA+溶劑鼠的淋巴結和脾臟細胞中IL-17的分泌量和表達IL-17+CD4+T細胞的百分比均明顯高于正常鼠的淋巴結和脾臟中IL-17的分泌量和IL-17+CD4+T細胞的百分比。這一結果進一步肯定了Th17細胞及其分泌的IL-17在CIA模型的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。經(jīng)Trip治療三周后，小鼠脾臟和淋巴結細胞中抗原特異性或抗原非特異性的IL-17和IL-17+CD4+T細胞的百分比均顯著降低。并且經(jīng)Trip治療的小鼠中CIA的發(fā)病率和臨

11、床評分均明顯下降。組織病理學結果說明與正常小鼠相比，病變踝關節(jié)出現(xiàn)可見大量的炎性細胞浸潤，破壞了軟骨面和骨組織。經(jīng)Trip治療后，軟骨及骨破壞的面積較CIA組明顯減少，疾病得到了控制。 在評價Trip對Th17分化的同時，我們還觀察了Th17極化條件和CIA模型中，Trip對IFN-γ產(chǎn)生的影響。值得注意的是：在Th17極化條件下，即經(jīng)IL-6+TGF-β的初次培養(yǎng)時，Trip抑制IFN-γ的產(chǎn)生；但是從細胞培養(yǎng)液中去除Trip

12、,在低濃度IL-2休息3天，再經(jīng)PMA+Ionomycin刺激后，初次培養(yǎng)時含有Trip的細胞組中IFN-γ的產(chǎn)生增加。在體內實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與CIA組鼠體內IFN-γ+CD4+T細胞的百分比相比，給Trip一周后的小鼠體內IFN-γ+CD4+T細胞的百分比增加。但是經(jīng)Trip三周后的小鼠體內IFN-γ+CD4+T細胞的百分比，與CIA組鼠體內IFN-γ+CD4+T細胞的百分比相比，是明顯下降的。 綜上所述，本實驗研究了多種細胞