Stx2e毒素酶活性位點突變體毒素生物學(xué)性及免疫保護性的研究.pdf

1、豬水腫病(Edema disease of swine，ED)是仔豬的一種急性致死性傳染病，主要由某些定殖于小腸的特定血清型、產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)引起，又稱為腸毒血癥。臨床上該病主要特征是胃大彎、腸系膜和腦部水腫，同時還常伴有共濟失調(diào)、驚厥或麻痹等神經(jīng)癥狀。引起豬水腫病的致病因素復(fù)雜，主要的毒力因子是F18菌毛和志賀毒素Ⅱ型變異體e亞型（Stx2e

2、）。
　　大腸桿菌pET-ABmu是由本實驗室構(gòu)建的可以同時表達Stx2eA亞單位（突變體）和Srx2eB亞單位的重組菌，在37℃、 IPTG濃度為0.5 mmol/L時表達最大量的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB，重組蛋白主要存在于沉淀中，蛋白分子量分別約為35kDa和7.5 kDa。重組蛋白已經(jīng)過Westem-blot證實抗原性良好。重組蛋白經(jīng)過透析純化后，經(jīng)頸部肌肉注射免疫仔豬，免疫后第7d即可產(chǎn)生抗體，在第4

3、2 d抗體達到最高，豬血清抗體效價可達到1∶5120。在Vero細胞水平上利用免疫豬血清做了對Stx2e粗提物的的中和試驗，結(jié)果表明免疫豬血清對Stx2e粗提物反應(yīng)后的中和滴度為26，說明免疫豬血清對Stx2e有較強的抑制作用。
　　用純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作為免疫原，腹腔注射免疫ICR小鼠，以驗證重組蛋白對于小鼠的毒性和免疫原性，免疫結(jié)束后用致死劑量的Stx2e粗提毒素進行攻毒，觀察重組蛋白對于小鼠

4、的免疫保護性效果。結(jié)果表明，腹腔注射重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB的小鼠無任何癥狀，表明重組蛋白對小鼠無毒性作用，用最小致死量(MLD)的Stx2e粗提物的攻毒試驗表明，腹腔注射重組蛋白能夠刺激小鼠機體產(chǎn)生有效的保護性抗體，且對小鼠的平均免疫保護率能夠達到93％以上，且小鼠在2個MLD劑量攻毒時的平均免疫保護率能夠達到90％，表明重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫小鼠能夠產(chǎn)生良好的免疫保護效果。
　

5、　用純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作為免疫原，經(jīng)頸部肌肉注射免疫三批次的35日齡的仔豬，以驗證重組蛋白對于仔豬的免疫保護效果，免疫結(jié)束后用致死劑量的Stx2e粗提毒素進行攻毒，觀察重組蛋白對于仔豬的免疫保護性效果。結(jié)果表明，頸部肌肉注射重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB免疫仔豬后，仔豬未出現(xiàn)異常癥狀，表明重組蛋白對仔豬無影響;在用致死量的Stx2e粗提物的攻毒試驗中，試驗組攻毒后有1頭發(fā)病，其余未發(fā)病，