小分子激酶抑制劑Midostaurin、Sorafenib及Vatalanib逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　 小分子激酶抑制劑(Protein kinase inhibitors，PKI)的應(yīng)用是近年腫瘤臨床治療的熱點，通過抑制處于細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵位點上的蛋白激酶可起到阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的效果，具有有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。位于細胞膜表面的ABC-轉(zhuǎn)運蛋白(ATP binding cassette(ABC) transporters)可依靠ATP供能，將細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)

2、和功能各異的化療藥物轉(zhuǎn)運出細胞外，是化療中腫瘤細胞的多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR)發(fā)生的重要原因。PKI在應(yīng)用中也遇到耐藥的困擾，近年來，一系列的研究表明MDR-ABC與PKI耐藥有密切聯(lián)系。同時，多項研究表明基于PKI與MDR-ABC間的作用關(guān)系，可通過聯(lián)合用藥克服MDR。一方面MDR-ABC會影響藥物的吸收、分布、代謝和清除，而另一方面一些親和力較高的PKI則被用于逆轉(zhuǎn)相應(yīng)ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的MDR。因此

3、對于兩者間作用關(guān)系的研究無論對于臨床用藥還是新藥開發(fā)都具有重要的意義。
　　 目的：
　　 對新型激酶抑制劑類抗癌藥Midostaurin，Sorafenib，Vatalanib用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性的效果進行評價，并對其相關(guān)機制進行探索。
　　 方法：
　　 將三種新型小分子激酶抑制劑同底物類抗癌與實驗室已有的ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、ABCC1/MRP1分別高表達的耐藥細胞株及

4、其親本共同作用，從細胞、功能、蛋白、基因等多個水平評價三種PKI逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的效果。
　　 (1)應(yīng)用MTS法或SRB法檢測PKI對耐藥細胞和敏感細胞的細胞毒性，并選取IC10以內(nèi)的用量與底物類抗癌藥共同作用，檢測其恢復(fù)MDR腫瘤細胞對抗癌藥敏感性的效果；
　　 (2)應(yīng)用流式細胞術(shù)分別以Rh-123、MX、ADR為熒光底物檢測耐藥細胞中PKI對于P-gp、BCRP、MRP1作為藥物外排泵的功能活性的影響；
　　

5、 (3)應(yīng)用Western Blot檢測PKI對耐藥細胞中P-gp、BCRP、MRP1蛋白表達水平的變化，及其對細胞內(nèi)增殖信號分子的影響；
　　 (4)應(yīng)用Realtime PCR檢測PKI對耐藥細胞中耐BCRP基因表達的水平的影響。
　　 (5)超速離心法制備含MDR-ABC的粗膜；應(yīng)用P-gp-GloTMAssay Sysetem檢測ATPase活性。
　　 結(jié)果：
　　 (1).以P-gp表達的K

6、562/A02及其親本細胞K562為模型體外評價Midostaurin逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)MDR的效果。Midostaurin500nM無毒濃度下，在細胞水平即可有效逆轉(zhuǎn)K562/A02對多種底物的耐藥；Midostaurin能顯著抑制P-gp的外排作用，增加底物Rh-123在K562/A02細胞中的積累；Midostaurin對P-gp的ATPase活性具有明顯的抑制作用；0.5μM的Midostaurin對P-gp基因與蛋白表達水以及A

7、KT和ERK的表達與磷酸化水平均無影響。
　　 (2).以耐藥細胞株K562/A02，HEK293/BCRP，HEK293/MRP1及其相應(yīng)敏感細胞株K562，HEK293/VEC為模型，研究了Sorafenib體外逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR的作用和機制。Sorafenib在2.5μM無毒濃度下可有效逆轉(zhuǎn)BCRP高表達耐藥細胞對底物MX、ADR和TOPT的耐藥，對P-gp和MRP1無明顯逆轉(zhuǎn)作用。Sorafenib特異性增加BCRP底物

8、MX在HEK293/BCRP細胞中的積累，對敏感細胞及P-gp和MRP1高表達的耐藥細胞無此作用。Sorafenib可激活BCRP的ATPase活性，是BCRP的底物，是MX和ADR結(jié)合BCRP的非競爭型抑制劑。Sorafenib可通引起B(yǎng)CRP構(gòu)象的改變。Sorafenib通過溶酶體途徑引起B(yǎng)CRP的降解并具有時間和劑量依賴性，而對P-gp和MRP1無此影響。Sorafenib對BCRP基因表達無顯著影響。2.5μM的Sorafeni

9、b對耐藥和敏感細胞中AKT和ERK及其磷酸化水平無顯著影響。
　　 (3).體外評價中，Vatalanib在5μM濃度下可有效逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的對MX、ADR和TOPT的耐藥，對P-gp和MRP1無逆轉(zhuǎn)作用。Vatalanib對BCRP外排MX無顯著的抑制作用。Vatalanib可激活BCRP的ATPase活性，但不改變BCRP的構(gòu)象。Vatalanib可引起B(yǎng)CRP蛋白水平的下調(diào)，并具有時間和劑量依賴效應(yīng)。Vatalanib可

10、降低BCRP的mRNA表達水平。Vatalanib對耐藥和敏感細胞中AKT和ERK及磷酸化水平無顯著影。
　　 結(jié)論：
　　 (1)Midostaurin可能是P-gp的非底物型抑制劑，通過抑制P-gp的外排功能高效逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥，具有第三代逆轉(zhuǎn)劑的部分特征，可被作為先導(dǎo)化合物供逆轉(zhuǎn)劑開發(fā)。
　　 (2)Sorafenib通過對BCRP功能抑制和蛋白降解兩種形式逆轉(zhuǎn)MDR，且具有較好的特異性，對指導(dǎo)S

11、orafenib臨床聯(lián)合BCRP底物化療具有一定意義。作為“雙效”BCRP抑制，Sorafenib結(jié)構(gòu)可供新型BCRP逆轉(zhuǎn)劑開發(fā)借鑒。Sorafenib是BCRP的底物，表明其BCRP過表達可能是其耐藥產(chǎn)生的原因。
　　 (3)Vatalanib在體外可有效逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的MDR，且具有良好的特異性，對指導(dǎo)Vatalanib臨床聯(lián)合BCRP底物化療有一定意義。Vatalanib可能是BCRP的底物，提示其出現(xiàn)耐藥可能與BCRP