靶向蛋白激酶C抑制劑篩選模型的建立及化合物的篩選與評價.pdf

1、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，由日本學者Nishizuka于1977年首次發(fā)現(xiàn)，為存在于細胞漿內由鈣激活的磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內信號傳遞的重要介質，具有多種功能。根據它們對Ca2+、DAG的依賴性，將其分為經典型PKC、新型PKC、非經典型PKC及PKCμ四大類。 早期研究表明PKC能夠被促腫瘤劑佛波酯(TPA)激活，隨后的大量研究進一步證實PKC在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中均發(fā)揮著重

2、要作用，使得PKC成為腫瘤疾病的重要治療靶點。研究表明，PKCα與腫瘤細胞的增殖、細胞周期調控及侵襲轉移密切相關；PKCβII參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和血管生成等多個環(huán)節(jié)：而PKCδ的激活則引起促進腫瘤形成的SHH信號通路及非經典的Wnt信號通路的活化。由此可見，PKC家族中的PKCα、PKcβII和PKCδ三種亞型與腫瘤關系密切，并且已有一些特異性抑制劑和寡聚核苷酸藥物進入臨床研究，如PKCα抑制劑Aprinocarsen，PKcβ抑

3、制劑Enzastaurin等，但是結果仍不盡人意。因此，建立以PKCα、PKCβII和PKCδ為分子靶點的亞型特異性PKC抑制劑篩選模型，將為開發(fā)抗腫瘤藥物提供活性篩選的技術平臺。 基于上述研究背景，本論文旨在利用熒光偏振技術和構建PKC表達水平不同的細胞株的方法，分別建立分子水平和細胞水平PKCα、PKCβII和PKCδ的抑制劑篩選模型，在此基礎上對化合物進行篩選，并初步評價活性化合物對腫瘤細胞行為學的影響。該論文的研究將為靶

4、向PKC抗腫瘤藥物的研發(fā)提供實驗基礎。 第一部分：分子水平PKC抑制劑篩選模型的建立 本部分實驗利用熒光偏振技術構建了分子水平的PKC抑制劑篩選模型，采用PKC經典抑制劑十字孢堿(staurosporine，SP)驗證該篩選模型，并進行化合物的篩選。結果表明：本部分實驗成功構建了分子水平的PKC抑制劑篩選模型，該模型穩(wěn)定可用，并篩選出對PKCβII具有抑制作用的化合物MD2-03。 第二部分：細胞水平PKC抑制劑

5、篩選模型的建立及活性化合物對腫瘤細胞行為學影響的評價。 本部分實驗采用逆轉錄病毒載體pBABE，構建了穩(wěn)定高表達PKC的Hek293-PKCα、Hek293-PKCβII和Hek293-PKCδ細胞株，應用Western Blot和免疫熒光化學方法對所構建的細胞株的PKC表達水平進行驗證；并采用PKC激活劑PMA和抑制劑SP驗證該細胞水平篩選模型的可信性，進一步應用該模型考察MD2-03在細胞水平中的作用，并在此基礎上初步評價了