柞蠶絲素-殼聚糖共混膜與大鼠頜下腺細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的：
　　 探討大鼠頜下腺細(xì)胞與柞蠶絲素-殼聚糖共混膜(Antheraeapemyisilkfibroin-chitosanfilms,ApSF-CSfilms)體外共培養(yǎng)的可行性,為組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 取0-8d齡SD大鼠的頜下腺,對(duì)大鼠頜下腺細(xì)胞(ratsubmandibularglandcells,RSMGs)進(jìn)行原代培養(yǎng)、分離純化、傳代;用抗細(xì)胞角

2、蛋白單克隆抗體(CK8)及淀粉酶抗體(amylase)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源。
　　 以ApSF-CS組為實(shí)驗(yàn)組;桑蠶絲素一殼聚糖共混膜(Bombyxmorisilkfibroin-chitosanfilms,BmSF-CSfilms)組、殼聚糖組(chitosanfilms)為對(duì)照組;并以單獨(dú)培養(yǎng)的RSMGs作為陰性對(duì)照組。將RSMGs以5×105/ml的密度均勻接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的支架材料上。
　　 掃描電

3、鏡、熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞支架復(fù)合生長(zhǎng)情況;分別于接種后1、4、8、12、24h檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞在支架上的黏附率;MTT比色法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力;Amano法測(cè)定上清液中淀粉酶含量,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及陰性對(duì)照組頜下腺細(xì)胞的分泌功能。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析,計(jì)量資料用(-x±s)表示,組間差異比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P＜0。05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、>　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞形態(tài)和表型特征
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察:上皮細(xì)胞特異性抗體CK8染色陽性,腺泡上皮細(xì)胞特異性抗體amylase染色陽性。掃描電鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各支架呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ApSF-CS組細(xì)胞植入初期時(shí),表面呈現(xiàn)圓球形,尚未向支架伸出足絲;隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞表面可見明顯凸起的微絨毛樣改變,細(xì)胞在支架表面向各個(gè)方向伸展并向支架材料伸出偽足,呈現(xiàn)平鋪狀生長(zhǎng),而且細(xì)胞與細(xì)胞間彼此伸出偽足相

5、連。熒光顯微鏡觀察:隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),ApSF-CS上錨定的種子細(xì)胞數(shù)量增多;RSMGs細(xì)胞核邊界清楚、形態(tài)呈圓形或橢圓形,核仁清晰可見:細(xì)胞較均勻的散布生長(zhǎng)在支架材料上,生長(zhǎng)良好。
　　 2、粘附率檢測(cè)
　　 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組支架材料上的細(xì)胞黏附率均有增大的趨勢(shì)。在接種后4、8、12h,細(xì)胞黏附率顯示ApSF-CS組、BmSF-CS組及CS組存在顯著性差異(P＜0.05)。接種后1h,三組材料上細(xì)

6、胞附著都較少;24h后三組材料的黏附率都達(dá)到95%以上,各組材料之間相比未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3、細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)
　　 在接種后3、5、7d,MTT法測(cè)得ApSF-CS組、BmSF-CS組、CS組及陰性對(duì)照組的OD值之間存在顯著性差異(P＜0.05)。接種后1d,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料上細(xì)胞增殖較少且無差異(P＞0.05),但均高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。第9d時(shí),OD值開始下降,細(xì)胞活力開始降低,

7、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料之間相比沒有顯著性差異(P＞0.05),但二者與陰性對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、淀粉酶含量的檢測(cè)
　　 隨著復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及陰性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的淀粉酶分泌量有不同程度的增加。在3d、5d、7d,ApSF-CS組、BmSF-CS組、CS組的唾液淀粉酶濃度有明顯差異(P＜0.05);在1d、3d、5d、7d,實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組都與陰性對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.0