柞蠶絲素-殼聚糖共混膜與大鼠頜下腺細胞體外復(fù)合培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的：
　　 探討大鼠頜下腺細胞與柞蠶絲素-殼聚糖共混膜(Antheraeapemyisilkfibroin-chitosanfilms,ApSF-CSfilms)體外共培養(yǎng)的可行性,為組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 取0-8d齡SD大鼠的頜下腺,對大鼠頜下腺細胞(ratsubmandibularglandcells,RSMGs)進行原代培養(yǎng)、分離純化、傳代;用抗細胞角

2、蛋白單克隆抗體(CK8)及淀粉酶抗體(amylase)的免疫細胞化學(xué)染色鑒定細胞來源。
　　 以ApSF-CS組為實驗組;桑蠶絲素一殼聚糖共混膜(Bombyxmorisilkfibroin-chitosanfilms,BmSF-CSfilms)組、殼聚糖組(chitosanfilms)為對照組;并以單獨培養(yǎng)的RSMGs作為陰性對照組。將RSMGs以5×105/ml的密度均勻接種于實驗組和對照組的支架材料上。
　　 掃描電

3、鏡、熒光顯微鏡觀察實驗組與對照組細胞支架復(fù)合生長情況;分別于接種后1、4、8、12、24h檢測實驗組與對照組細胞在支架上的黏附率;MTT比色法檢測實驗組、對照組及陰性對照組細胞的增殖能力;Amano法測定上清液中淀粉酶含量,檢測實驗組、對照組及陰性對照組頜下腺細胞的分泌功能。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析,計量資料用(-x±s)表示,組間差異比較采用方差分析,檢驗水準α=0.05,以P＜0。05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、>　　 結(jié)果：
　　 1、細胞形態(tài)和表型特征
　　 免疫細胞化學(xué)染色觀察:上皮細胞特異性抗體CK8染色陽性,腺泡上皮細胞特異性抗體amylase染色陽性。掃描電鏡觀察:實驗組和對照組各支架呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ApSF-CS組細胞植入初期時,表面呈現(xiàn)圓球形,尚未向支架伸出足絲;隨共培養(yǎng)時間的延長,細胞表面可見明顯凸起的微絨毛樣改變,細胞在支架表面向各個方向伸展并向支架材料伸出偽足,呈現(xiàn)平鋪狀生長,而且細胞與細胞間彼此伸出偽足相

5、連。熒光顯微鏡觀察:隨著共培養(yǎng)時間的延長,ApSF-CS上錨定的種子細胞數(shù)量增多;RSMGs細胞核邊界清楚、形態(tài)呈圓形或橢圓形,核仁清晰可見:細胞較均勻的散布生長在支架材料上,生長良好。
　　 2、粘附率檢測
　　 隨著培養(yǎng)時間的延長,實驗組和對照組支架材料上的細胞黏附率均有增大的趨勢。在接種后4、8、12h,細胞黏附率顯示ApSF-CS組、BmSF-CS組及CS組存在顯著性差異(P＜0.05)。接種后1h,三組材料上細

6、胞附著都較少;24h后三組材料的黏附率都達到95%以上,各組材料之間相比未見顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3、細胞增殖能力的檢測
　　 在接種后3、5、7d,MTT法測得ApSF-CS組、BmSF-CS組、CS組及陰性對照組的OD值之間存在顯著性差異(P＜0.05)。接種后1d,實驗組和對照組材料上細胞增殖較少且無差異(P＞0.05),但均高于陰性對照組(P＜0.05)。第9d時,OD值開始下降,細胞活力開始降低,

7、實驗組和對照組材料之間相比沒有顯著性差異(P＞0.05),但二者與陰性對照組有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4、淀粉酶含量的檢測
　　 隨著復(fù)合培養(yǎng)時間的延長,實驗組、對照組及陰性對照組細胞培養(yǎng)上清液中的淀粉酶分泌量有不同程度的增加。在3d、5d、7d,ApSF-CS組、BmSF-CS組、CS組的唾液淀粉酶濃度有明顯差異(P＜0.05);在1d、3d、5d、7d,實驗組、對照組都與陰性對照組有顯著性差異(P＜0.0