攜帶海葵溶細胞素Equinatoxin Ⅱ的溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、第一章攜帶?？芗毎谽quinatoxinⅡ的溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究
　　隨著惡性腫瘤對人類的威脅越來越大，尋找一種新的、能有效治療癌癥的方法已成為癌癥相關(guān)工作者的主要任務(wù)之一。腫瘤的靶向基因-病毒療法結(jié)合了基因治療和病毒療法的優(yōu)勢，利用病毒為載體，將目的基因整合到病毒載體上，從而達到有效殺死腫瘤細胞的目的，為腫瘤治愈帶來了新的希望。
　　腺病毒作為病毒療法中的首選病毒，不僅安全、宿主范圍廣、穩(wěn)定性好、而且不易

2、突變，容易獲得較高的滴度。
　　為了增強腺病毒對腫瘤細胞的殺傷作用，我們選擇了EquinatoxinⅡ(EqtⅡ)作為腫瘤治療基因插入到腺病毒載體上。EqtⅡ是一種?？芗毎?，作為水溶性的蛋白，通過靜電引力和疏水作用與脂膜發(fā)生相互作用，?？芗毎厥紫韧ㄟ^正電荷與磷脂雙分子層表面的負電荷結(jié)合，緊接著112-116位色氨酸豐富區(qū)和膜發(fā)生初步結(jié)合，最后海葵溶細胞素的N端雙親性螺旋區(qū)插入膜內(nèi)，形成三聚體或四聚體以形成陽離子通道，且此過

3、程為不可逆過程。此外，在之前的報道中提到，EqtⅡ不僅具有較強的溶血作用，而且也能夠有效抑制腫瘤細胞增殖。
　　在本論文的研究中，我們利用Adeasy腺病毒包裝系統(tǒng)，將外源基因EqtⅡ插入到重組腺病毒載體中，構(gòu)建出非復(fù)制型病毒Ad-EqtⅡ和復(fù)制型病毒SD55-EqtⅡ。利用Western Blot檢測目的蛋白，目的病毒能夠在腫瘤細胞中正常復(fù)制和表達。利用MTT比色法檢測目的病毒對腫瘤細胞的殺傷作用以及對正常肝細胞L02的安全性，

4、目的病毒不僅表出了良好的抗腫瘤活性，而且對肝癌細胞的毒性較正常肝細胞大。結(jié)晶紫染色結(jié)果表明目的病毒具有良好的抗腫瘤活性。Hoechst33342初步說明目的病毒誘導(dǎo)細胞死亡途徑與凋亡無關(guān)。
　　第二章天然吡喃酮的結(jié)構(gòu)修飾及其抗腫瘤活性研究
　　天然抗腫瘤藥物具有低毒、活性高、來源廣等諸多優(yōu)點，使其抗腫瘤活性研究已經(jīng)成為了天然產(chǎn)物的研究熱點。苯并二氫吡喃環(huán)是二氫吡喃中主要發(fā)揮活性的結(jié)構(gòu)部分，為了提高該類天然產(chǎn)物的抗腫瘤活性，以

5、天然吡喃類化合物為母版進行結(jié)構(gòu)修飾與合成，以期獲得抗腫瘤活性更好，毒副作用小的衍生物。
　　PI3K/Akt信號通路具有承載著多方面的功能，例如抑制細胞凋亡，促進細胞生長，促進血管生成，是細胞生存的重要通路之一。而Akt基因是PI3K/Akt通路的核心，研究表明，Akt在多種腫瘤細胞中存在著過度表達以及活化的現(xiàn)象，Akt已被定義為癌基因，Akt基因的深入研究有可能為研究開發(fā)出新的抗腫瘤藥物以及方法提供一定的理論依據(jù)。
　　本

6、課題在前期的研究基礎(chǔ)上，開展藥物作用的信號通路與PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路之間的關(guān)系，尋找潛在的藥物靶分子，為研發(fā)新型二氫吡喃類抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。
　　通過對天然吡喃酮的結(jié)構(gòu)修飾與合成，我們獲得了36種衍生物，通過對其活性的初步篩選，我們決定圍繞化合物L(fēng)iQ-1進行對天然吡喃酮的結(jié)構(gòu)修飾及其抗腫瘤活性研究。
　　MTT法檢測化合物對細胞的抑制作用，結(jié)果顯示藥物對A549、SMMC-7721、SGC-7901、K562

7、、K562/Akt、MCF-7的IC50分別為30.08、55.28、57.45、34.28、39.26和64.97μM，表明化合物對癌細胞均具備了較強的殺傷能力，并通過生長曲線的繪制發(fā)現(xiàn)化合物對藥物的作用呈計量依賴關(guān)系。
　　Hoechst33342染色結(jié)果觀察到經(jīng)化合物處理后的細胞出現(xiàn)核固縮、凋亡小體等明顯的凋亡現(xiàn)象。再利用Western Blot法檢測化合物處理肺癌細胞株A549，48小時后，細胞內(nèi)的caspase3、9和P

8、ARP這三種蛋白的表達量水平，發(fā)現(xiàn)其相比于對照均有明顯的下降，說明化合物通過凋亡途徑誘導(dǎo)細胞死亡。
　　最后通過Q-PCR檢測化合物作用人紅白血病細胞K562之后，細胞內(nèi)Akt基因的表達水平，結(jié)果顯示實驗組與對照組相比，Akt基因的表達水平略有下降，而Akt基因往往在癌細胞內(nèi)是過分活躍的，表明化合物也有可能通過對Akt基因的抑制來誘導(dǎo)細胞凋亡，這與本文最初的猜測想符合，Akt有可能成為新的藥物靶標分子，為研制開發(fā)出新的抗腫瘤藥物提