GSK3β、CLIP-170在小鼠氣道上皮損傷與修復中的表達變化及其意義.pdf

1、急慢性支氣管炎引起氣道粘膜上皮細胞損傷，在其后的修復過程中，周圍上皮細胞遷移、分裂增生和分化，以重新覆蓋受損區(qū)域。細胞遷移時細胞形態(tài)改變、胞膜突起的定向及中心體的極化，分裂時染色體的捕獲及紡錘體的形成和定向，這些細胞活動過程均有賴于微管、微絲、RhoGTP酶及微管相關蛋白之間復雜的相互作用。RhoGTP酶是Ras超家族中小分子量G蛋白的成員之一，是一組分子量約為20～25kd的鳥苷酸結合蛋白，在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器或分子開

2、關，作用于細胞骨架或其靶蛋白而產(chǎn)生多種生物效應，包括Cdc42、RhoA、Rac等，其中以Cdc42研究最多。微管相關蛋白包括APC(adenomatouspolyposiscoli)、EB1(end-bindingprotein)、CLIP一170(cytoplasmiclinkerprotein-170)和CLASP(CLIP-associatedprotein)等，它們結合在微管正極上，參與微管動力學和功能的調(diào)節(jié)。糖原合成酶激酶3

3、β(glycogensynthasekinase3β，GSK3β)在細胞內(nèi)呈組成性激活，APC和CLASP都是其底物。GSK3β活性改變及其對一些微管相關蛋白的磷酸化修飾，能夠影響微管的動力學和功能，進而影響細胞的遷移、分裂等生命活動。 目的 研究GSK3β及CLIP-170在博萊霉素引起的小鼠氣道上皮損傷和修復中的表達變化及其意義，以進一步闡明上皮損傷后修復的分子機制。 方法 健康昆明種小鼠(雌雄不拘)

4、36只，腹腔注射麻醉后經(jīng)氣管插管一次性緩慢注入BLMA55mg/kg，誘導其氣道上皮急性損傷。隨后分批處死小鼠，獲取肺組織和氣管，以6只正常小鼠作為對照。用免疫組織化學S-P法檢測GSK3β及CLIP-170蛋白在氣道上皮細胞中的定位與表達；用westernblot技術檢測GSK3β、P-GSK3β、Cdc42及CLIP-170在損傷修復過程中表達的動態(tài)變化；并用免疫雙標和共聚焦顯微鏡技術檢測GSK3β及CLIP-170分別與微管蛋白β

5、-tubulin的共定位關系。 結果 一、大體觀察： 正常組小鼠雙肺紅潤，表面光滑，彈性良好。實驗組小鼠肺組織出現(xiàn)點狀出血、腫脹，后期肺組織體積縮小、硬度增加等不同程度的病理變化。 二、HE鏡下觀察： 光鏡下正常氣道上皮細胞排列整齊，為假復層纖毛柱狀上皮或纖毛柱狀上皮。實驗組小鼠肺組織炎性細胞浸潤，氣道及肺泡上皮細胞壞死、脫落，纖毛倒伏，繼而炎性細胞減少，上皮細胞修復，肺間質(zhì)成纖維細胞增生，纖維化

6、。 三、免疫組化染色： GSK3β在正常對照組氣道上皮細胞質(zhì)內(nèi)表達水平較高，BLM刺激后4d及7d時GSK3β表達迅速降低(P＜0.01)，而在隨后的14d及28d時又有所回升(P＜0.01)，但仍低于對照組；CLIP-170在正常對照組細胞質(zhì)內(nèi)呈低表達，實驗組則隨著損傷的進行而表達逐漸升高，兩組間差別具有顯著性意義(P＜0.01)。 四、westernblot檢測： GSK3β在實驗組早期損傷階段水平降

7、低，修復末期回升(P＜0.01)；P-GSK3β呈相反變化。Cdc42在實驗組早期損傷階段升高，隨后漸呈下降趨勢(P＜0.05)；CLIP-170在實驗組給予BLM后呈持續(xù)升高趨勢，與對照組比較，P＜0.01。 五、免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測： β-tubulin在正常對照組小鼠氣道上皮中分布較彌散，BLM刺激后4d、7dβ-tubulin明顯沿氣道上皮細胞近腔面和側緣細胞膜下呈線狀分布，肺泡上皮細胞質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)表達。CL

8、IP-170及GSK3β的分布與β-tubulin比較一致，BLM14d、28d時，CLIP-170、GSK3β和β-tubulin均出現(xiàn)向胞質(zhì)內(nèi)側轉移、彌散分布的趨勢。 結論 1.GSK3β的磷酸化與Cdc42調(diào)節(jié)有關； 2.GSK3β和P-GSK3β在氣道上皮損傷與修復過程中呈波動性變化并在形態(tài)學上與微管共定位，提示其可能參與調(diào)節(jié)微管相關蛋白在微管正極末端的聚集與結合； 3.CLIP-170在氣道上皮