羊膜接觸鏡的研制及其在兔角膜上皮損傷修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：利用PMMA環(huán)研制新型羊膜接觸鏡，探討其在不同程度兔角膜上皮損傷修復(fù)中的應(yīng)用效果。 方法: 羊膜接觸鏡的制備方法及其在兔中央角膜上皮損傷修復(fù)中的應(yīng)用PMMA環(huán)根據(jù)兔眼結(jié)膜囊的印模磨制。16只兔左眼均去除中央10mm角膜上皮，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組羊膜片用PMMA環(huán)和纖維蛋白膠固定：PMMA環(huán)包裹在羊膜中，塞入結(jié)膜囊后，折疊的羊膜之間及羊膜與PMMA環(huán)之間注入纖維蛋白膠以加固羊膜的支撐作用，但是纖維蛋白膠不用來(lái)粘附眼表

2、的任何部位。對(duì)照組羊膜用10-0尼龍縫線間斷縫合。術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察7天，記錄上皮愈合情況及并發(fā)癥，計(jì)數(shù)每種并發(fā)癥的兔只數(shù)，T-test比較兩組之間的差異。羊膜接觸鏡聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植在兔角膜緣損傷修復(fù)中的應(yīng)用制備兔角膜緣及角膜上皮損傷模型，培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞，消化收集后接種于Matrigel包被的培養(yǎng)皿中貼壁20分鐘，收集貼壁的細(xì)胞(2X105個(gè)/眼)注射到羊膜接觸鏡與損傷的眼表之間(n=8)，并在體外檢測(cè)細(xì)胞形成復(fù)層的能力。術(shù)后

3、24小時(shí)后更換羊膜，如果熒光素呈彌漫性染色，則重復(fù)細(xì)胞注射，對(duì)照組不注射細(xì)胞，僅植入羊膜接觸鏡(n=8)，空白對(duì)照組損傷后不做處理，裂隙燈照相隨訪2周，計(jì)數(shù)角膜上皮合、角膜感染、新生血管、角膜上皮缺損的兔只數(shù)，單因素方差分析比較兩兩之間的差異。 結(jié)果: 羊膜接觸鏡的在兔中央角膜上皮損傷修復(fù)中的應(yīng)用兩組中的兔角膜上皮均在5天后愈合，兩組間角膜上皮愈合時(shí)間、周邊角膜新生血管均無(wú)顯著性差別。在無(wú)縫線組，所有的羊膜在隨訪期間保持

4、完整，1只兔結(jié)膜由于暴露于PMMA環(huán)而出現(xiàn)部分上皮缺損，在對(duì)照組，觀察到50％以上的兔實(shí)驗(yàn)眼出現(xiàn)結(jié)膜水腫，縫線松脫，植片脫落，點(diǎn)狀出血，和部分結(jié)膜上皮缺損(各種并發(fā)癥的兔只數(shù)在兩組間的差別P<0.05)。 羊膜接觸鏡聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植在兔角膜緣損傷修復(fù)中的應(yīng)用免疫組化染色顯示20分鐘內(nèi)貼壁的角膜緣細(xì)胞Ki67(+)，integrinα6(+)，integrinβ1(+)，P63(+)，少數(shù)細(xì)胞K3/K12陽(yáng)性，且細(xì)胞可在氣-液

5、界面培養(yǎng)1周后形成復(fù)層結(jié)構(gòu)，HE染色可見細(xì)胞排列模式接近正常角膜上皮組織，電鏡下可見微絨毛、緊密連接等超微結(jié)構(gòu)。20分鐘后貼壁的細(xì)胞呈Cx43(+)，K3/K12陽(yáng)性，細(xì)胞移植后第14天，實(shí)驗(yàn)組6/8只兔眼表上皮得以重建，羊膜組每只兔出現(xiàn)不同程度的結(jié)膜化表現(xiàn)或新生血管，1只兔角膜上皮愈合不良，空白對(duì)照組表現(xiàn)為3只兔感染、5只兔角膜上皮缺損，均表現(xiàn)為周邊角膜新生血管、愈合不良，感染等。單因素方差分析結(jié)果顯示A組和B損傷愈合均優(yōu)于空白組(P

6、<0.05)，A組新生血管少于B組和C組(P<0.05)，B組與C組之間新生血管沒有差異，但是C組愈合不良、感染顯著高于B組。免疫組化染色顯示實(shí)驗(yàn)組角膜區(qū)域上皮K3/K12(+)、Occludin(+)、integrinα6(+)、MUC5AC(-)，表明是角膜上皮表型，而對(duì)照組角膜上皮MUC5AC(+)、K3/K12(-)，為結(jié)膜上皮表型。 結(jié)論: 羊膜接觸鏡在兔中央角膜上皮損傷修復(fù)中的應(yīng)用利用PMMA環(huán)聯(lián)合纖維蛋白膠

7、在眼表固定羊膜的并發(fā)癥遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)的間斷縫合法，這種羊膜接觸鏡固定技術(shù)可避免縫線所固有的并發(fā)癥，減輕病人痛苦、大大節(jié)省手術(shù)時(shí)間，在修復(fù)中央角膜缺損時(shí)可以替代傳統(tǒng)縫線固定技術(shù)。羊膜接觸鏡聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植在兔角膜緣損傷修復(fù)中的應(yīng)用羊膜接觸鏡聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植可以用于角膜緣損傷后的上皮再生修復(fù)，這種基于單細(xì)胞的眼表重建技術(shù)可以避開角膜上皮組織重建、收集中的技術(shù)難題，并節(jié)省組織構(gòu)建所需的時(shí)間，PMMA環(huán)-羊膜接觸鏡與組織工程技術(shù)的結(jié)合是我