糖皮質(zhì)激素抑制BALB-c小鼠哮喘氣道上皮損傷后修復(fù)的機(jī)制及干預(yù)研究.pdf

1、第一部分 DEX對哮喘BALB/c小鼠氣道上皮修復(fù)和AHR形成的影響
　　目的:觀察地塞米松(DEX)對哮喘氣道上皮及氣道高反應(yīng)(AHR)的影響，了解氣道中性粒細(xì)胞和氣道脫落上皮細(xì)胞在其中的相關(guān)性。
　　方法:將哮喘小鼠分為四組:正常對照組(naive)、哮喘組(asthma)、哮喘低劑量激素干預(yù)組(asthma+DEX1)、哮喘高劑量激素干預(yù)組(asthma+DEX5)。在最后一次霧化24 h內(nèi)，小鼠依次進(jìn)行AHR檢測、支

2、氣管肺泡灌洗和BALF細(xì)胞計數(shù)、或取氣管和肺病理組織。BALF細(xì)胞沉渣涂片用于細(xì)胞分類計數(shù)。病理組織用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫組化染色。
　　結(jié)果:短程DEX干預(yù)可加劇哮喘氣道上皮的缺損。DEX盡管能明顯下調(diào)哮喘氣道中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)，但是在AHR控制方面仍不甚理想?？筀i-67免疫組化染色顯示DEX抑制了哮喘氣道上皮細(xì)胞的分裂，抗caspase3免疫組化染色顯示DEX抑制氣道上皮細(xì)胞凋亡的效果有限。氣道

3、中性粒細(xì)胞與脫落氣道上皮細(xì)胞呈明顯相關(guān)性，此外兩者與AHR指標(biāo)penh50均呈明顯正相關(guān)。
　　結(jié)論:短程DEX干預(yù)一定程度上減少了哮喘氣道上皮細(xì)胞的丟失，但同時也明顯抑制了氣道上皮的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致了氣道上皮缺口的擴(kuò)大。此外，氣道中性粒細(xì)胞聚集也可能會加重氣道上皮的損傷。氣道上皮損傷和中性粒細(xì)胞氣道聚集可能是引起哮喘AHR的密切相關(guān)因素。
　　第二部分 VitA對哮喘BALB/c小鼠氣道上皮增殖、凋亡及氣道炎癥的影響

4、　　目的:觀察Vit A對哮喘氣道上皮完整性及哮喘氣道炎癥的影響。
　　方法:將哮喘小鼠分為四組:正常對照組(naive)、哮喘組(asthma)、哮喘低劑量Vit A干預(yù)組(asthma+VitA25)、哮喘高劑量Vit A干預(yù)組(asthma+VitA250)。在最后一次霧化24 h內(nèi)，小鼠依次進(jìn)行AHR檢測、支氣管肺泡灌洗和BALF細(xì)胞計數(shù)、或取氣管和肺病理組織。BALF上清液用于細(xì)胞因子檢測，細(xì)胞沉渣涂片用于細(xì)胞分類計數(shù)。

5、病理組織用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫組化染色。
　　結(jié)果:VitA可減少哮喘氣道脫落上皮數(shù)，明顯減輕了氣道中性粒細(xì)胞的聚集，并下調(diào)氣道TGF-β1水平?？筩aspase3免疫組化染色顯示VitA能抑制氣道上皮細(xì)胞凋亡，且明顯下調(diào)AHR?？筀i-67免疫組化染色未明確顯示VitA對哮喘氣道上皮增殖的促進(jìn)作用。氣道中性粒細(xì)胞與脫落氣道上皮細(xì)胞、氣道中性粒細(xì)胞數(shù)量與AHR指標(biāo)penh50均呈相關(guān)性。
　　結(jié)論:

6、VitA可明顯減輕哮喘小鼠氣道上皮的損傷，下調(diào)AHR和中性粒細(xì)胞的聚集。尚未明顯觀察到VitA是否促進(jìn)氣道上皮的增殖。氣道中性粒細(xì)胞聚集可加重氣道上皮的損傷，與AHR密切相關(guān)。
　　第三部分 DEX聯(lián)合GILZ沉默和聯(lián)合VitA對BALB/c哮喘小鼠氣道上皮和氣道炎癥的影響
　　目的:觀察GILZ基因沉默或Vit A是否逆轉(zhuǎn)DEX對哮喘氣道上皮的負(fù)面影響。
　　方法:霧化激發(fā)前4d將GILZ沉默腺病毒或空載腺病毒感染哮

7、喘小鼠，其余干預(yù)同前。在最后一次霧化24 h內(nèi)，小鼠依次進(jìn)行AHR檢測、支氣管肺泡灌洗和BALF細(xì)胞計數(shù)、或取氣管和肺病理組織。 BALF細(xì)胞沉渣涂片用于細(xì)胞分類計數(shù)。病理組織用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫組化染色。
　　結(jié)果:DEX聯(lián)合GILZ基因沉默或VitA都明顯減少了哮喘氣道脫落上皮數(shù)，DEX聯(lián)合VitA可明顯下調(diào)哮喘AHR?？筩aspase3免疫組化染色顯示DEX聯(lián)合Vit A可明顯抑制氣道上皮細(xì)胞凋亡

8、;DEX聯(lián)合GILZ基因沉默輕度下調(diào)氣道上皮細(xì)胞凋亡水平?？筀i-67免疫組化染色未明確顯示GILZ基因沉默、Vit A聯(lián)合DEX對哮喘氣道上皮增殖的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論:VitA和GILZ基因沉默可明顯減少DEX引起的哮喘小鼠氣道上皮損傷，但兩者對氣道上皮增殖的影響尚不明確。
　　第四部分 DEX、VitA和GILZ沉默對哮喘小鼠氣道EGFR/Raf-1/MEK/Erk信號通路的影響
　　目的:觀察DEX和Vit A

9、對EGFR/Raf-1/MEK/Erk信號通路的影響;探討DEX和VitA通過調(diào)節(jié)GILZ影響EGFR/Raf-1/MEK/Erk信號通路的作用。
　　方法:提取各組小鼠肺組織mRNA，合成cDNA，通過qPCR方法檢測EGFR/Raf-1/MEK/Erk信號通路各分子的轉(zhuǎn)錄活性。提取小鼠肺組織蛋白，通過Western Blot(WB)方法檢測EGFR/Raf-1/MEK/Erk信號通路各分子的表達(dá)及活化情況。通過免疫組化方法檢測

10、相關(guān)分子的組織分布和含量變化。
　　結(jié)果:qPCR和WB顯示DEX和Vit A可以改變Raf-1、MEK1/2和Erk1/2的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平。免疫組化顯示DEX可以誘導(dǎo)肺部GILZ的表達(dá)，且DEX濃度越高，誘導(dǎo)越明顯;VitA對GILZ的表達(dá)無明顯影響;DEX減弱了Erk1/2的表達(dá)，但聯(lián)合維生素則可維持相對較高的Erk1/2表達(dá);GILZ沉默可以增強(qiáng)Erk1/2的表達(dá)。
　　結(jié)論:DEX通過誘導(dǎo)GILZ參與Raf-1/