白血病診療免疫基礎(chǔ)的若干探索.pdf

1、隨著免疫學(xué)的發(fā)展和免疫機(jī)制在白血病發(fā)生發(fā)展中作用的逐步闡明，免疫學(xué)技術(shù)、方法和原理在白血病診療中發(fā)揮越來越重要的作用。本文對(duì)抗白血病腫瘤疫苗和新型白細(xì)胞介素在造血系統(tǒng)中的作用進(jìn)行了若干探索，取得了新的進(jìn)展。 第一部分：小鼠β-防御素2瘤苗的構(gòu)建及抗白血病L1210作用的研究 天然免疫一度被認(rèn)為只是免疫系統(tǒng)應(yīng)答外界刺激的低級(jí)形式，近年研究發(fā)現(xiàn)天然免疫對(duì)獲得性免疫起直接的激活和導(dǎo)向作用。天然免疫通過模式識(shí)別受體(PRR)作用

2、賦予獲得性免疫識(shí)別“自己”和“非己”的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)天然免疫抗菌肽小鼠β-防御素2(MBD2)不僅能夠趨化不成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，還可通過PRR激活DC成熟，產(chǎn)生一系列前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子，上調(diào)共刺激分子，可能是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。我們將MBD2轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞白血病L1210細(xì)胞，制備細(xì)胞瘤苗觀察其抗白血病免疫效果。首先用RT-PCR法從LPS刺激的小鼠皮膚細(xì)胞克隆MBD2成熟部分基因片斷，用overlapPC

3、R法將小鼠Igk信號(hào)肽與MBD2成熟片斷相連，構(gòu)建MBD2分泌表達(dá)載體(pMBD2)，經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列正確后，脂質(zhì)體法將空載體及pMBD2分別轉(zhuǎn)染L1210細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系(分別命名為L(zhǎng)1210-p和L1210-MBD2)。Westernblot證實(shí)轉(zhuǎn)染的腫瘤疫苗細(xì)胞可以表達(dá)并分泌MBD2。用Transwell檢測(cè)瘤苗細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)不成熟DC遷移的作用，證實(shí)瘤苗細(xì)胞表達(dá)的MBD2有功能活性。生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證實(shí)與未轉(zhuǎn)染的腫瘤

4、細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染空載體和pMBD2對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無明顯影響。FACS檢測(cè)MHCⅠ(H-2Kd，H-2Dd)，MHCⅡ(I-Ad)分子，共刺激分子CD80、CD86表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染空載體或pMBD2后，L1210細(xì)胞上述分子的表達(dá)亦無明顯改變。隨后進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗白血病效果評(píng)價(jià)。體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)和免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L1210-MBD2瘤苗能顯著降低L1210細(xì)胞的致瘤性，80％小鼠長(zhǎng)期生存；經(jīng)野生型L1210

5、二次攻擊后全部小鼠仍然長(zhǎng)期生存，并產(chǎn)生腫瘤特異性CTL。荷瘤小鼠皮下注射MBD2照射瘤苗，觀察其治療效果，結(jié)果表明：照射瘤苗治療能明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期，50％小鼠達(dá)到長(zhǎng)期生存?？鼓[瘤機(jī)制研究顯示，接種L1210-MBD2瘤苗能顯著增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的NK、CTL殺傷活性，IFN-γ水平亦有明顯升高?？贵w刪除實(shí)驗(yàn)顯示，所有CD8+T及NK細(xì)胞刪除小鼠接種L1210-MBD2后均發(fā)病死亡，而刪除CD4+T細(xì)胞亞群對(duì)L1210-MBD2的

6、抗腫瘤活性無影響，提示NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞為其抗腫瘤活性所必需，但不需要CD4+T細(xì)胞參與。由于急性淋巴細(xì)胞白血病往往表現(xiàn)對(duì)NK細(xì)胞高度耐受，本文發(fā)現(xiàn)MBD2介導(dǎo)的抗小鼠淋巴細(xì)胞白血病需要NK細(xì)胞可能具有重要意義。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MBD2轉(zhuǎn)基因瘤苗具有明顯的抗小鼠白血病L1210效應(yīng)，能同時(shí)激活天然免疫(NK細(xì)胞)和獲得性免疫(T細(xì)胞)，為淋巴細(xì)胞白血病的免疫治療開拓了新的思路。 第二部分：白介素-23和-12亞

7、基在人外周血單個(gè)核細(xì)胞及造血細(xì)胞系中的表達(dá)與調(diào)控 IL-12是由p35和p40兩個(gè)亞基組成的異二聚體細(xì)胞因子，IL-12及其誘導(dǎo)的IFN-γ在Th1免疫反應(yīng)的分化發(fā)育中起關(guān)鍵作用。IL-23是新發(fā)現(xiàn)的異二聚體細(xì)胞因子，結(jié)構(gòu)與IL-12相似，由IL-12p40亞基和一個(gè)新的p19亞基組成。迄今，人類外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)IL-23亞基表達(dá)的誘導(dǎo)劑和調(diào)控模式尚不清楚。本文檢測(cè)各類細(xì)胞因子、細(xì)菌產(chǎn)物、絲裂原對(duì)PBMC及造血細(xì)胞系

8、IL-23、IL-12表達(dá)的刺激作用，并探討脂多糖(LPS)和金黃色葡萄球菌(SAC)誘導(dǎo)IL-23表達(dá)的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)，正常人PBMC表達(dá)IL-23p19和IL-12p35mRNA，LPS、SAC均可上調(diào)PBMCIL-23及IL-12各亞基的表達(dá)水平。LPS誘導(dǎo)的IL-23和IL-12各亞基表達(dá)均需通過CD14；但是，CD14僅部分參與SAC誘導(dǎo)的IL-12p40和p35表達(dá)上調(diào)，而與p19上調(diào)無關(guān)。LPS和SAC誘導(dǎo)的IL-23和I

9、L-12各亞基表達(dá)均需要p38MAPK通路。上述結(jié)果為單獨(dú)或同時(shí)調(diào)控這兩種因子的表達(dá)提供線索。此外，植物血凝素(PHA)可促進(jìn)CD4+、CD8+T細(xì)胞IL-23p19表達(dá)，而對(duì)IL-12p35、p40表達(dá)無調(diào)節(jié)作用。干擾素-γ(IFN-γ)預(yù)處理后予LPS刺激可使單核細(xì)胞IL-23p19，IL-12p35和IL-12p40表達(dá)高于LPS直接作用的表達(dá)水平。檢測(cè)的大多數(shù)白血病細(xì)胞系均表達(dá)p19mRNA，p19比p35表達(dá)更為普遍；而p40