基于白血病細(xì)胞胞外體(exosomes)的白血病免疫治療的體外研究.pdf

1、在我國(guó)兒童及35歲以下成人因惡性腫瘤所致的死亡率中，白血病居第1位。盡管化療和放療，尤其是造血干細(xì)胞移植，顯著地改善了白血病等惡性血液病的預(yù)后。但是，白血病治療后的復(fù)發(fā)率仍然居高不下。究其原因，化、放療以及造血干細(xì)胞移植后患者體內(nèi)微小殘留白血病灶(MRD)是引起復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。目前人類對(duì)疾病的研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，因此誘導(dǎo)抗白血病細(xì)胞免疫治療以根除MRD，已成為減少和預(yù)防白血病治療后復(fù)發(fā)的新研究方向。胞外體(exosomes，EXO)是一

2、種可由多種真核細(xì)胞分泌的膜性囊泡，在樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)的協(xié)助下，可在實(shí)體瘤中可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。已有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠白血病細(xì)胞系L1210也可分泌負(fù)載抗原分子和其他免疫效應(yīng)分子的EXO，并產(chǎn)生抗白血病免疫應(yīng)答。為了了解人白血病細(xì)胞系分泌的EXO的性質(zhì)及其對(duì)抗白血病免疫功能的影響，探索其蛋白質(zhì)組成，本研究進(jìn)行了下列三部分實(shí)驗(yàn)。
　　 第一章白血病細(xì)胞系來源EXO的分離、定量和鑒定
　　 [目

3、的]分別從培養(yǎng)的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562和人早幼粒白血病細(xì)胞系NB4的培養(yǎng)液上清中分離EXO，并對(duì)其進(jìn)行定量和鑒定。
　　 [方法]收集K562和NB4細(xì)胞無血清培養(yǎng)的上清液，通過分步離心去除細(xì)胞碎片，超速離心、蔗糖重水密度梯度離心結(jié)合超濾離心的方法分離EXO。使用免疫電鏡和Western Blot方法對(duì)EXO進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)志的鑒定。通過Bradford蛋白定量法對(duì)EXO進(jìn)行間接定量。
　　 [結(jié)果]K562

4、和NB4細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中成功分離獲得了EXO。透射電鏡形態(tài)學(xué)鑒定、免疫電鏡膠體金技術(shù)和Western Blot分子標(biāo)志鑒定的符合性良好。平均每毫升K562細(xì)胞培養(yǎng)液上清可獲得EXO約(6.1±0.9)μg，平均每毫升NB4細(xì)胞培養(yǎng)液上清可獲得EXO約(4.4±0.7)μg。
　　 [結(jié)論]從細(xì)胞培養(yǎng)上清中可以有效提純白血病細(xì)胞系的 EXO。Bradford蛋白定量法是一種簡(jiǎn)便的EXO間接定量法，但并非最精確的方法。
　　

5、 第二章白血病細(xì)胞系來源EXO致敏人DC誘導(dǎo)抗白血病作用
　　 [目的]探討K562和NB4細(xì)胞系來源的EXO致敏人DC，能否進(jìn)一步提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷活性。
　　 [方法]體外分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用GM-CSF、IL-4和 TNF-α三種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，培養(yǎng)出形態(tài)和表型為DC的細(xì)胞。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察DC對(duì)EXO的吞噬作用。采用CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性試劑盒檢測(cè)在不同效靶比時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)

6、胞的殺傷率，并對(duì)之進(jìn)行比較。
　　 [結(jié)果]實(shí)驗(yàn)中成功分離培養(yǎng)了DC和淋巴細(xì)胞，DC能夠攝取EXO。經(jīng)檢測(cè)，在效靶比分別為12.5:1、25:1和50:1時(shí)，DC組對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率分別為(13.5±2.3)％、(15.6±2.8)％、(18.1±3.4)％，DC+K562 EXO組分別為(22.6±2.5)％、(31.9±3.4)％、(47.5±4.7)％；DC組對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷率分別為(12.5±2.8)％、(14.3

7、±3.6)％、(17.2±3.3)％，DC+NB4 EXO組分別為(20.7±2.8)％、(27.1±3.2)％、(35.1±4.0)％。兩種細(xì)胞的組別比較均有顯著性差異(P<0.01)。
　　 [結(jié)論]無論在K562細(xì)胞系，還是NB4細(xì)胞系中，EXO均能增強(qiáng)DC的提呈功能，增加外周血淋巴細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞系的殺傷活性。
　　 第三章白血病細(xì)胞系來源EXO的蛋白質(zhì)組分鑒定
　　 [目的]探究K562 EXO與其來源

8、細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的相似性，并通過對(duì)K562 EXO鑒定蛋白的功能分析，推測(cè)K562白血病細(xì)胞系來源的EXO的生理意義。
　　 [方法]將EXO懸液和來源細(xì)胞裂解液進(jìn)行二維電泳使得蛋白質(zhì)組分按照分子量和等電點(diǎn)的差異分開。將分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)酶切消化后通過Shotgun法進(jìn)行鑒定。
　　 [結(jié)果]二維電泳結(jié)果顯示EXO所含蛋白量遠(yuǎn)少于來源細(xì)胞。Shotgun法為我們提供了更多的信息，K562 EXO主要含有胞內(nèi)腔室、胞質(zhì)和部分胞膜