MSCs聯(lián)合G-CSF對(duì)兔梗死心肌修復(fù)作用的MR與病理對(duì)照研究.pdf

1、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用超順磁性氧化鐵(SPIO)標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，旨在明確多聚賴氨酸(PLL)介導(dǎo)SPIO標(biāo)記干細(xì)胞的安全性及其對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活性影響；通過MR動(dòng)態(tài)觀察移植標(biāo)記干細(xì)胞的存活、分布范圍及遷徙的情況；Cine-MR評(píng)價(jià)兔心肌梗死后心功能及治療后心功能變化情況；病理觀察干細(xì)胞的存活及分布特點(diǎn)；結(jié)合免疫組化CD34、VEGF的表達(dá)以及凋亡細(xì)胞的分布及計(jì)數(shù)，探討MSCs移植及G-CSF注射對(duì)梗死心肌的修

2、復(fù)作用，探尋兔心肌梗死MSCs移植治療更有效的移植時(shí)機(jī)及配伍，為臨床干細(xì)胞移植治療心肌缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用全骨髓貼壁法對(duì)MSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)；光鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特征并記錄其生長(zhǎng)曲線；通過流式細(xì)胞儀對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行表面抗原(CD34和CD44)的檢測(cè)。采用PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記干細(xì)胞；對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，觀察標(biāo)記效率；臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞的活力；MTT法觀察干細(xì)胞增殖活性。兔左冠狀動(dòng)脈

3、前降支(LAD)低位雙重結(jié)扎制備兔心肌梗死模型，于梗死后3天或7天行MSCs移植和/或粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)注射。MR動(dòng)態(tài)觀察移植干細(xì)胞的存活、分布范圍及遷徙情況；Cine-MR評(píng)價(jià)治療后心功能變化情況。最后經(jīng)病理學(xué)檢查觀察梗死心肌形態(tài)、移植細(xì)胞的存活及遷徙；免疫組織化學(xué)觀察CD34、VEGF的表達(dá)；TUNEL染色法計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，綜合分析MSCs及G-CSF對(duì)兔梗死心肌的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.干細(xì)胞分

4、離、培養(yǎng)：骨髓細(xì)胞懸液接種后24小時(shí)可見細(xì)胞貼擘，培養(yǎng)72小時(shí)細(xì)胞局部呈漩渦狀生長(zhǎng)，原代細(xì)胞培養(yǎng)7-12天可傳代，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，約2天即可傳代。
　　 2.干細(xì)胞鑒定、標(biāo)記及活性測(cè)定：獲得的MSCs呈長(zhǎng)梭形、纖維狀貼壁生長(zhǎng)；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，表面抗原CD34、CD44+細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的95％以上；標(biāo)記組與未標(biāo)記組細(xì)胞臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)均為98％左右；普魯士藍(lán)染色顯示99％以上的干細(xì)胞胞漿中含有藍(lán)色鐵顆粒；MTT結(jié)果顯示

5、標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞生長(zhǎng)曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.MR表現(xiàn)①信號(hào)改變：MR可清晰成像移植的標(biāo)記MSCs，表現(xiàn)為T2WI及T2*WI境界清晰的點(diǎn)狀或小片狀低信號(hào)區(qū)，隨著時(shí)間推移，低信號(hào)范圍逐漸擴(kuò)大、邊界變模糊，直至消失；移植后4周，低信號(hào)影未見顯示。②Cine-MR:梗死3天移植各組左室前壁增厚率與射血分?jǐn)?shù)(EF)均未見明顯提高(P>0.05)；梗死7天移植組中，MSCs組、G-CSF組、MSCs+G-CS

6、F組左室前壁增厚率大于PBS注射組(P<0.05)，MSCs組與MSCs+G-CSF組EF值較PBS對(duì)照組有所增高(P<0.05)，且MSCs+G-CSF組EF值增高較明顯(P<0.01)。
　　 4.病理表現(xiàn)：各MSCs組和MSCs+G-CSF組切片普魯士藍(lán)染色見胞漿內(nèi)含藍(lán)色鐵顆粒的陽性細(xì)胞散在分布于梗死邊緣區(qū)。
　　 5.TUNEL染色：凋亡細(xì)胞分布于梗死邊緣區(qū)，梗死3天移植組及梗死7天移植組中，MSCs組、MSCs

7、+G-CSF組與PBS對(duì)照組相比較，凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)；G-CSF組與PBS對(duì)照組相比較，凋亡細(xì)胞數(shù)未見明顯差異(P>0.05)。
　　 6.免疫組化：梗死3天移植組及梗死7天移植組中，MSCs組、G-CSF組、MSCs+G-CSF組與PBS對(duì)照組相比較，VEGF表達(dá)增加(P<0.05)，CD34標(biāo)記毛細(xì)血管計(jì)數(shù)增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁法可以成功分離、培養(yǎng)MSCs，操作

8、簡(jiǎn)便易行，實(shí)用價(jià)值高。
　　 2.獲得的MSCs活性高、傳代能力強(qiáng)，可以保持未分化表型而快速增殖。
　　 3.PLL介導(dǎo)Resovis可以安全、高效地標(biāo)記MSCs，且不影響MSCs的生長(zhǎng)、增殖等生物學(xué)特性。
　　 4.LAD根部下5mm低位雙重結(jié)扎建立兔心肌梗死模型成功率高、仿真性好、可重復(fù)性強(qiáng)。
　　 5.MR可對(duì)移植到兔梗死心肌內(nèi)的標(biāo)記MSCs進(jìn)行活體示蹤，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè)干細(xì)胞的存活與遷徙情況

9、，表現(xiàn)為T2WI、T2*WI局灶性低信號(hào)影，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，低信號(hào)范圍逐漸擴(kuò)大、邊緣變模糊，直至消失。
　　 6.Cine-MR可以較客觀的評(píng)價(jià)兔心肌梗死后心功能及細(xì)胞移植治療后心功能的改善情況；MSCs移植及MSCs與G-CSF聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)心功能改善，而單純注射G-CSF心功能恢復(fù)不明顯。
　　 7.病理觀察發(fā)現(xiàn)部分移植干細(xì)胞在梗死邊緣區(qū)存活并向周圍組織遷移。
　　 8.MSCs移植與注射G-CSF能夠使梗死邊