G-CSF聯(lián)合VEGF對APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型突解可塑性的影響.pdf

1、研究背景:阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能損害為主要特征性表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，是老年期癡呆最常見的類型，該病為慢性進(jìn)行性病程，其致殘率及致死率很高，其發(fā)病機(jī)制卻不很清楚，目前主要有β淀粉樣蛋白、乙酰膽堿神經(jīng)元、基因、一氧化氮、微觀相關(guān)蛋白tau、細(xì)胞因子、炎癥等多種因素可能與AD的發(fā)病有關(guān)。許多研究表明，突觸丟失、神經(jīng)元脫失是AD患者重要的組織形態(tài)學(xué)改變之一，其程度與癡呆嚴(yán)重程度密

2、切相關(guān)。
　　 AD目前尚無比較有效的治療方法。傳統(tǒng)的藥物治療主要有:改善腦循環(huán)藥物、促進(jìn)腦代謝劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑、M1膽堿受體激動劑、促進(jìn)乙酰膽堿釋放劑、神經(jīng)生長因子、抗氧化藥物等，這些治療手段能夠減輕AD的癥狀，但無法恢復(fù)大量丟失的神經(jīng)細(xì)胞，對于中晚期的AD患者治療效果很有限。近來研究表明在合適的環(huán)境中干細(xì)胞能轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞，起到修復(fù)受損神經(jīng)組織的作用。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)在胚胎和成年個(gè)體神

3、經(jīng)系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)和體外培養(yǎng)的成功為AD的治療提供了一個(gè)新的途徑和方向。利用自體干細(xì)胞修復(fù)受損神經(jīng)組織的方法具有簡便、很少引起免疫排斥反應(yīng)，而且沒有倫理學(xué)問題的困擾，因而具有長遠(yuǎn)而廣泛的應(yīng)用前景。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，G-CSF)作為調(diào)節(jié)骨髓粒系造血的主要細(xì)胞因子之一，有動員骨髓干細(xì)胞增殖的作用，并使動員到外周的骨髓干細(xì)胞向腦損傷區(qū)遷移，修復(fù)受損的神經(jīng)組織，從而改善AD小鼠

4、模型認(rèn)知功能。體外人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)成年鼠腦的研究結(jié)果表明，G-CSF可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是強(qiáng)力的促血管生成因子，與VEGF受體結(jié)合后可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及生長，并形成血管網(wǎng)，血供的改善能夠?yàn)樯窠?jīng)的再生創(chuàng)造良好的環(huán)境，有利于神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VEGF還直接作用于神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長和延伸，有較強(qiáng)的

5、神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生作用。由此我們設(shè)想將VEGF與G-CSF兩者聯(lián)合應(yīng)用可能起到相互協(xié)同作用，更好得促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的增殖、遷移、分化，可能有利于神經(jīng)組織的再生，改善突觸可塑性。
　　 研究目的:第一部分:應(yīng)用水迷宮檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期、空間探索策略及傳越原平臺所在象限次數(shù)及游泳時(shí)間百分比，探討G-CSF聯(lián)合VEGF對APP轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的影響。第二部分:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測APP轉(zhuǎn)基因小鼠CD133，通過免疫

6、熒光染色方法，檢測BrdU+GAP-43，以期探討G-CSF/VEGF聯(lián)合干預(yù)對干細(xì)胞增殖和神經(jīng)再生的影響。第三部分:應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記方法，檢測BrdU+SYN，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測NCAM，探討G-CSF/VEGF聯(lián)合干預(yù)對突觸可塑性的影響
　　 材料與方法:
　　 第一部分
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物及給藥:Appv7171轉(zhuǎn)基因小鼠54只，隨機(jī)分為G-CSF及VEGF聯(lián)合組（簡稱聯(lián)合組）、G-CSF組合對照

7、組，每組18只小鼠，首先連續(xù)3天給予腹腔注射VEGF(8μg/kg·d)，之后再連續(xù)7天給予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。G-CSF組:共18只，首先連續(xù)3天給予腹腔注射與VEGF同體積的PBS，之后連續(xù)7天皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。對照組:共18只，首先連續(xù)3天給予腹腔注射與VEGF同體積的PBS，再連續(xù)7天給予皮下注射與G-CSF同體積的生理鹽水。各組小鼠再分為7天，14天機(jī)28天3個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只

8、小鼠。
　　 2.行為學(xué)檢測:各組小鼠分別在給藥前及給藥后第7天、14天及28天進(jìn)行Morris水迷宮測試，觀察小鼠尋找并爬上平臺的路線，記錄小鼠活動路線圖及爬上平臺所需時(shí)間（逃避潛伏期）;之后將平臺撤除進(jìn)行小鼠的空間探索測試，記錄60秒內(nèi)小鼠再水池中的游動路線，計(jì)算出在60秒中小鼠在原平臺所在的象限中游泳時(shí)間百分比，同時(shí)計(jì)算出小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以（x）±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采

9、用應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，各組間差異采用方差分析，60秒中小鼠在原平臺象限的游泳時(shí)間百分比、小鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥本實(shí)驗(yàn)共選用APP轉(zhuǎn)基因小鼠54只，經(jīng)過初篩之后，按照隨機(jī)分配的原則將所有小鼠隨機(jī)分為3組:G-CSF聯(lián)合VEGF組（簡稱聯(lián)合組）、G-CSF組和對照組，并分別給與不同的藥物處理。聯(lián)合組:共18只，首先連

10、續(xù)3天給予腹腔注射VEGF(8μg/kg·d)，之后，再連續(xù)7天給予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。G-CSF組:共18只，首先連續(xù)3d給予腹腔注射PBS，之后連續(xù)7d給予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。對照組:共18只，首先連續(xù)3d給予腹腔注射PBS，再連續(xù)7d給予皮下注射生理鹽水。各組小鼠在給藥的同時(shí)，均連續(xù)10d給予腹腔注射BrdU(50mg/kg·d)。各組動物再按照隨機(jī)分配原則分為7、14、28d3個(gè)亞組，

11、每個(gè)亞組均為6只小鼠，分別于給藥結(jié)束后第7天、14天、28天將小鼠處死并進(jìn)行取腦。
　　 2.腦標(biāo)本采集
　　 各組小鼠在給藥后7、14、28d腹腔注射10％水合氯醛(0.38g/kg)進(jìn)行麻醉，成功后依次給予PBS和4％多聚甲醛進(jìn)行灌注固定，直到四肢僵直為止，然后取出腦部。將腦組織投入4％多聚甲醛溶液進(jìn)行后固定20小時(shí)，之后依次放入30％及20％蔗糖溶液中各24小時(shí)。最后將固定后的小鼠腦部放入冰凍切片機(jī)中，經(jīng)海馬部制作

12、冠狀切片，片厚15μm，用于免疫組織化學(xué)組化檢測。
　　 3.CDI33免疫組織化學(xué)檢測
　　 根據(jù)CDI33抗體說明書所示的操作方法，CDI33免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟如下:將冰凍切片在室溫中放置30分鐘之后，用PBS液清洗3次，每次5分鐘。再放入3％過氧化氫溶液中進(jìn)行孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶對免疫組織化學(xué)結(jié)果的影響。再次用PBS清洗3次，每次5分鐘，室溫中再放入3％過氧化氫液10-20分鐘，之后使用PBS

13、洗滌2次，每次3分鐘。室溫條件下放入正常血清中進(jìn)行孵育20分鐘后滴加CDI33抗體，4℃過夜。采用PBS液清滌3次，每次3分鐘。再滴加二抗，在室溫條件下靜置30分鐘，以PBS液清洗3次，每次3分鐘。在室溫條件下上液中加入PAP復(fù)合物靜置60分鐘，以PBS液清洗3次，每次3分鐘。最后使用0.04％DAB液加0.03％過氧化氫溶液顯色約5-10分鐘后充分水洗，采用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，晾干后封片顯微鏡下觀察。
　　 4.BrdU+GAP-

14、43免疫熒光雙標(biāo)記檢測
　　 取冰凍切片，室溫復(fù)溫后，0.3％TritonX-100，30min，PBS洗3×5min;采用2MHCl37℃下處理60分鐘，PBS液清洗3次，每次5分鐘。然后滴加5％BSA封閉液，在室溫下靜置20分鐘。之后甩去上面的液體，不用清洗。再滴加1∶100倍稀釋的BrdU一抗，在4℃環(huán)境下過夜。PBS液洗滌3次，每次2分鐘。滴加1∶100倍稀釋的SYN一抗，在4℃環(huán)境下經(jīng)過一夜時(shí)間后，以PBS液清洗3次，

15、每次2分鐘。其上再滴加山羊抗小鼠TRITC偶聯(lián)二抗與山羊抗兔FITC偶聯(lián)二抗的混合液（先經(jīng)1∶100稀釋后），在37℃環(huán)境下靜置20分鐘。PBS清洗3次，每次2分鐘，最后進(jìn)行封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。BrdU陽性細(xì)胞顯示為紅色熒光，GAP-43陽性細(xì)胞為綠色熒光，BrdU/GAP-43雙陽性細(xì)胞為黃色熒光，分別對BrdU/GAP-43雙陽性細(xì)胞、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出BrdU/GAP-43雙陽性細(xì)胞占BrdU陽性細(xì)胞的百

16、分?jǐn)?shù)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 CD133免疫組織化學(xué)檢測:在400倍顯微鏡下對海馬區(qū)5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行隨機(jī)計(jì)數(shù)，應(yīng)用LeicaQWinV3圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算平均灰度值。GAP-43/BrdU免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)記檢測:首先對GAP-43/BrdU雙標(biāo)記陽性細(xì)胞及BrdU陽性細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，對腦片海馬區(qū)5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行隨機(jī)計(jì)數(shù)，計(jì)算出GAP-43/BrdU雙標(biāo)記陽性細(xì)胞占BrdU陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。應(yīng)用SPSS

17、10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以(x)±s表示，組間差異比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三部分:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥
　　 本實(shí)驗(yàn)共選用APP轉(zhuǎn)基因小鼠54只，經(jīng)過初篩之后，按照隨機(jī)分配的原則將所有小鼠隨機(jī)分為3組:G-CSF聯(lián)合VEGF組（簡稱聯(lián)合組）、G-CSF組和對照組，并分別給與不同的藥物處理。聯(lián)合組:共18只，首先連續(xù)3天給予腹腔注射VEGF(8μg/kg

18、·d)，之后，再連續(xù)7天給予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。G-CSF組:共18只，首先連續(xù)3d給予腹腔注射PBS，之后連續(xù)7d給予皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。對照組:共18只，首先連續(xù)3d給予腹腔注射PBS，再連續(xù)7d給予皮下注射生理鹽水。各組小鼠在給藥的同時(shí)，均連續(xù)10d給予腹腔注射BrdU(50mg/kg·d)。各組動物再按照隨機(jī)分配原則分為7、14、28d3個(gè)亞組，每個(gè)亞組均為6只小鼠，分別于給藥結(jié)束后第

19、7天、14天、28天將小鼠處死并進(jìn)行取腦。
　　 2.腦標(biāo)本采集
　　 各組小鼠在給藥后7、14、28d腹腔注射10％水合氯醛(0.38g/kg)進(jìn)行麻醉，成功后依次給予PBS和4％多聚甲醛進(jìn)行灌注固定，直到四肢僵直為止，然后取出腦部。將腦組織投入4％多聚甲醛溶液進(jìn)行后固定20小時(shí)，之后依次放入30％及20％蔗糖溶液中各24小時(shí)。最后將固定后的小鼠腦部放入冰凍切片機(jī)中，經(jīng)海馬部制作冠狀切片，片厚15μm，用于免疫組織化學(xué)

20、組化檢測。3.BrdU+SYN免疫熒光雙標(biāo)記檢測
　　 將冰凍切片在室溫進(jìn)行復(fù)溫之后，首先采用0.3％TritonX-100處理30分鐘，之后再用PBS清洗3次，每次5分鐘;采用2MHC1在37℃下處理60分鐘，再用PBS清洗3次，每次5分鐘。之后滴加5％BSA液進(jìn)行封閉，室溫持續(xù)20分鐘。甩去切片上的多余液體，不用清洗。滴加1∶100經(jīng)過稀釋的brdU一抗，在4℃條件下過夜，用PBS清洗3次，每次2分鐘。在切片上滴加1∶100

21、稀釋的SYN一抗，在4℃條件下過夜，PBS清洗3次，每次2分鐘。最后滴加山羊抗小鼠TRITC偶聯(lián)二抗，以及1∶100稀釋的山羊抗兔FITC偶聯(lián)二抗的混合液，在37℃條件下持續(xù)20分鐘。PBS清洗3次，每次2分鐘。全部步驟完成再封片。在熒光顯微鏡下，觀察BrdU陽性細(xì)胞、BrdU/SYN雙陽性細(xì)胞情況，計(jì)數(shù)BrdU/SYN雙陽性細(xì)胞、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算每個(gè)切片BrdU雙陽性細(xì)胞占BrdU陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
　　 4.CA免

22、疫組織化學(xué)檢測
　　 根據(jù)NCAM免疫組織化學(xué)染色說明書要求，具體操作步驟簡述如下:將冰凍切片在室溫下放置30分鐘，PBS液洗滌5分鐘，共3次。再使用3％過氧化氫溶液進(jìn)行孵育5-10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。再進(jìn)行PBS洗滌5分鐘，共洗3次，再次使用3％過氧化氫室溫下孵育10-20分鐘，之后PBS洗滌3分鐘，共2次。使用二抗的正常血清在室溫下進(jìn)行孵育20分鐘，再滴加NCAM抗體溶液，在4℃環(huán)境下經(jīng)過一夜后，用PBS液進(jìn)行洗

23、滌3分鐘，共3次。之后滴加二抗，在室溫下靜置30分鐘后PBS液洗滌3分鐘，共3次。再加PAP復(fù)合物保持室溫下反應(yīng)60分鐘，PBS液進(jìn)行洗滌3分鐘，共3次。最后采用0.04％DAB+0.03％H2O2顯色5-10分鐘，充分用水進(jìn)行洗滌，干后使用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 SYN免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)記檢測:計(jì)數(shù)SYN/BrdU雙陽性細(xì)胞占BrdU陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。對海馬區(qū)5個(gè)不重疊

24、的視野進(jìn)行隨機(jī)計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算平均數(shù)。NCAM免疫組織化學(xué)檢測:在400倍顯微鏡下對海馬區(qū)5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行隨機(jī)計(jì)數(shù)，應(yīng)用LeicaQWinV3圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算平均灰度值。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以(x)±s表示，組間差異比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:1.逃避潛伏期檢測:給藥之前3組小鼠逃避潛伏期相差不大。其中聯(lián)合組61.74±11.

25、51s，G-CSF組62.91±27.22s，對照組:60.98±17.11s，P＞0.05。給予G-CSF及G-CSF、VDGF聯(lián)合干預(yù)后，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，G-CSF組及聯(lián)合組小鼠認(rèn)知功能明顯改善，逃避潛伏期縮短，3組間有明顯差異。在給藥7天后即出現(xiàn)，聯(lián)合組23.73±12.50s，G-CSF組27.19±4.07s，對照組46.07±7.21s，P＜0.05。14天時(shí)有顯著差異，聯(lián)合組20.22±9.28s，G-CSF組26.48±

26、5.29s，對照組42.99±11.70s，P＜0.01。到28天時(shí)效果仍很明顯，聯(lián)合組20.81±10.46s，G-CSF組24.97±3.61s，對照組45.54±9.55s，P＜0.01。
　　 2.搜索平臺策略:實(shí)驗(yàn)小鼠采用的搜索平臺策略有3種:空間策略、系統(tǒng)搜索策略和重復(fù)環(huán)繞策略。對照組小鼠多采用的是重復(fù)環(huán)繞策略，7天時(shí)為23％，14天39％，28天25％;各時(shí)間點(diǎn)小鼠采用空間搜索策略的比例大致相仿，占29％-33％。

27、系統(tǒng)搜索策略分別為7天時(shí)45％，14天時(shí)39％，28天時(shí)52％。給予G-CSF后與對照組相比，搜索策略略有差別，G-CSF組小鼠以空間策略為主，各時(shí)間點(diǎn)比例較高:7天45％，14天55％，28天63％;系統(tǒng)搜索策略所占比例:7天38％，14天30％，28天20％;重復(fù)環(huán)繞策略較少采用:7天17％，14天15％，28天17％。給予G-CSF聯(lián)合VEGF后小鼠搜索策略以空間策略比例顯著增加，各時(shí)間點(diǎn)比例為:7天68％，14天76％，28天8

28、0％;系統(tǒng)搜索策略所占比例:7天23％，14天13％，28天10％;重復(fù)環(huán)繞策略:7天9％，14天11％，28天10％。經(jīng)卡方分析各時(shí)間點(diǎn)三組間均有明顯差別，P＜0.05。
　　 3.小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)及原平臺象限游泳時(shí)間百分比:將平臺撤除后第7天時(shí)，聯(lián)合組、G-CSF組及對照組穿過原平臺所在位置的次數(shù)較對照組相比未發(fā)現(xiàn)明顯增加:對照組2±2.58，G-CSF組2±2.53，聯(lián)合組2±3.26，P＞0.05。第14天G

29、-CSF組和聯(lián)合組小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)有明顯增加:對照組2.67±2.16，G-CSF組4.5±1.64，聯(lián)合組6.5±3.81，P＜0.05。第28天對照組3.24±1.63，G-CSF組5.23±1.61，聯(lián)合組6.23±1.89，P＜0.05。聯(lián)合組、G-CSF組和對照組間經(jīng)卡方分析發(fā)現(xiàn)有顯著差異，但28天時(shí)差別較14天時(shí)略有減少。原平臺象限游泳時(shí)間百分比:7天時(shí)對照組35.38±5.33％，G-CSF組34.37±7.4

30、3％，聯(lián)合組:37.24±5.71％，P＞0.05，聯(lián)合組、G-CSF組與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。14天時(shí)對照組35.12±14.13％，G-CSF組56.24±17.19％，聯(lián)合組59.24±18.69，P＜0.05。第28天時(shí)，對照組35.67±9.79，G-CSF組48.42±16.41，聯(lián)合組54±14.37，P＜0.05，聯(lián)合組、G-CSF組和對照組間均有明顯差異，但差別較14天時(shí)減小。
　　 第二部分:
　　

31、 1.CD133免疫組織化學(xué)染色
　　 在CD133免疫組織化學(xué)染色片中，CD133主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜表面，呈境界清晰的棕黃色，隨著給藥時(shí)間的延長，CD133陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，對照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD133的表達(dá)均處于較低水平，給藥后7、14、28d聯(lián)合組較G-CSF組和對照組表達(dá)明顯增高，P＜0.05。
　　 2.BrdU/GAP-43免疫熒光雙標(biāo)記染色
　　 在海馬區(qū)Brdu/GAP-43熒

32、光染色片中，Brdu陽性細(xì)胞標(biāo)記為紅色，GAP-43陽性細(xì)胞標(biāo)記為綠色。可見部分標(biāo)記為黃色的Brdu/GAP-43雙標(biāo)記陽性細(xì)胞。聯(lián)合組在給藥后7d起即可見到較多的雙標(biāo)記陽性細(xì)胞，隨給藥時(shí)間的延長，雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，28d時(shí)雙標(biāo)記陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)達(dá)(17.26±3.29)％，在7d、14d、28d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均較G-CSF干預(yù)組及對照組明顯增加，P＜0.05。
　　 第三部分:
　　 1.B

33、rdU/SYN免疫熒光雙標(biāo)記染色應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)染色，熒光顯微鏡下觀察，在海馬區(qū)BrdU/SYN熒光染色切片中，紅色標(biāo)記的是BrdU陽性神經(jīng)細(xì)胞，為干細(xì)胞來源，綠色標(biāo)記的是SYN陽性神經(jīng)細(xì)胞，為新生突觸，可見部分TRITC標(biāo)記的紅色BrdU陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)FITC標(biāo)記SYN（綠色），為干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中新生突觸蛋白。聯(lián)合組在給藥后第7天即可見BrdU/SYN雙標(biāo)記陽性細(xì)胞，并隨時(shí)間的延長，雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，28d時(shí)BrdU

34、/SYN雙標(biāo)記陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)達(dá)(14.47±1.38)％，14、28d時(shí)聯(lián)合組較G-CSF組及對照組SYN陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯增加，P＜0.05。
　　 2.NCAM免疫組織化學(xué)染色在NCAM免疫組織化學(xué)片中，NCAM呈棕褐色，主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜表面，從用藥后第7天起聯(lián)合組NCAM陽性神經(jīng)細(xì)胞緩慢增加，在給藥后14d、28d聯(lián)合組NCAM較G-CSF干預(yù)組及對照組表達(dá)明顯增高，P＜0.05
　　 結(jié)論:

35、　　 第一部分:給予APPV7171轉(zhuǎn)基因小鼠G-CSF能顯著減輕小鼠認(rèn)知功能損害，其作用自用藥后7天出現(xiàn)，可持續(xù)到28天，給予G-CSF/VEGF聯(lián)合用藥，可顯著促進(jìn)小鼠的認(rèn)知功能，其作用較G-CSF組更加明顯。
　　 第二部分:G-CSF聯(lián)合VEGF能提高APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)干細(xì)胞標(biāo)記物CDI33的表達(dá)水平，增強(qiáng)干細(xì)胞在腦損傷區(qū)的增殖。G-CSF聯(lián)合VEGF能增加APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型神經(jīng)再生標(biāo)志物GAP-43的表達(dá)水平，