E3B1基因的表達調(diào)控與軸突再生的相關性研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文E3B1基因的表達調(diào)控與軸突再生的相關性研究姓名：向強申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（骨外）指導教師：周躍20080501第三軍醫(yī)入學博士學位論文建立大鼠急性脊髓損傷模型，采用免疫組織化學、RT—PCR、Westernblot研究方法，動態(tài)觀測大鼠脊髓損傷前后脊髓組織中E381蛋白和E381mRNA的表達變化，分析了E3Bl基因表達變化在脊髓損傷中的意義。2、大鼠皮層神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)、鑒定和CNS髓鞘質的提取、

2、鑒定對大鼠大腦皮層組織進行原代分離培養(yǎng)，觀察其生長和形態(tài)結構，并采用GFAP與NF200熒光標記，確認神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量。提取了CNS髓鞘質，觀測不同濃度CNS髓鞘質對神經(jīng)元軸突生長的影響，選取最適實驗濃度，并采用westemblot進行成分鑒定。3、神經(jīng)元細胞E3Bl基因的表達變化檢測1)采用免疫細胞化學觀測了E381在培養(yǎng)神經(jīng)元細胞中的表達分布，采用RT—PCR、Westernblot檢測培養(yǎng)神經(jīng)元細胞中E381mRNA和E3Bl蛋

3、白的表達。2)培養(yǎng)神經(jīng)元細胞中加入提取的軸突生長抑制物CNS髓鞘質，采用RT—PCR、Westemblot檢測了神經(jīng)元軸突抑制時E381蛋白和E381mRNA的表達變化。3)采用免疫熒光標記對比觀測了培養(yǎng)神經(jīng)元細胞加入cNs髓鞘質前后，E3Bl和BIII—tubulin在神經(jīng)元細胞中的表達變化，分析了E3Bl基因表達變化與神經(jīng)元軸突生長抑制的相關性。4、E381基因的表達調(diào)控對培養(yǎng)神經(jīng)元細胞軸突再生的影響1)針對E3Bl的RNA干擾質粒

4、載體的構建：選擇針對E3Bl(NCBI：NM—024397)的RNAi靶位點三個(分別命名為Abill，Abil2，Abil3)和已明確的不針對任何mRNA的RNAi靶位點～個(陰性對照，命名HK)，以及陽性對照GAPDH—A，選用帶有neoR選擇標志和GFP綠色熒光標志的真核表達載體pGenesil—1構建E3BlRNAi質粒。并進行了抗性篩選、酶切、測序鑒定。2)RNA干擾對神經(jīng)元細胞E381表達的影響研究：將構建好的RNAi質粒載

5、體通過“pofectamine2000依次轉染培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞，采用熒光顯微鏡檢測轉染率，RT—PCR和Westernblot檢測針對E381不同靶位點的RNAi對神經(jīng)元細胞E381基因表達的影響，并篩選出了對E381基因具有最佳抑制效應的siRNA。3)調(diào)控E3Bl表達對神經(jīng)元軸突生長的影響：將篩選出的對E3Bl基因具有最佳抑制效應的siRNA轉染神經(jīng)元細胞，經(jīng)抗性篩選，加入軸突生長抑制物，采用BIII—tubu】in免疫熒光標記和w