IL28B基因多態(tài)性及其表達(dá)與慢性丙型肝炎的相關(guān)性研究.pdf

1、丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的慢性傳染性疾病，目前世界上約有1.7億人感染HCV，中國約有3700～4000萬。HCV感染后，20％～30％感染者會發(fā)生自發(fā)性清除，但70％～80％將會持續(xù)感染，如得不到合理治療將有30％的持續(xù)感染者最終會發(fā)展成肝硬化和肝癌。不同個體患者對聯(lián)合治療的應(yīng)答存在較大的差異，近幾年來宿主因素越來越多引起關(guān)注，例如性別、年齡、種族和肝纖維化程度。最近，幾個全基因

2、組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)IL28B基因(編碼干擾素λ3)附近的幾個單核苷酸多態(tài)性(SNP)與HCV病毒自發(fā)性清除、慢性感染發(fā)生率和干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的效果有十分密切的關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究表明，在丙型肝炎人群中，IL28B基因多態(tài)性與HCV自發(fā)清除及能力有關(guān)，自發(fā)性清除組和健康對照組人群中IL28B血清學(xué)水平和mRNA表達(dá)明顯高于慢性HCV持續(xù)感染組。IL28B基因主要與受體IL10RB和IL28RA結(jié)合結(jié)合，啟動JAK-STAT途徑，通過調(diào)節(jié)ISG

3、s發(fā)揮抗病毒作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)，攜帶rs8099917 TT基因型的在丙型肝炎患者，其肝臟中IL28B和主要抗病毒干擾素刺激基因(MxA，PKR，OAS1，ISG15)的mRNA表達(dá)顯著低于攜帶GT/GG的患者;同時在PBMC中的表達(dá)則沒有顯著性差異;可以通過檢測肝臟內(nèi)的IL28B和ISGs的表達(dá)預(yù)測干擾素抗病毒治療應(yīng)答。有研究表明，外周血單個核細(xì)胞內(nèi)的IL28B和ISGs的表達(dá)也與持續(xù)性病毒應(yīng)答相關(guān)，并且體內(nèi)和體外的表達(dá)是一致

4、的，可以通過體外培養(yǎng)PBMC，檢測IL28B和ISGs的mRNA表達(dá)預(yù)測患者接受聚乙二醇干擾素抗病毒治療應(yīng)答。
　　目的：
　　本研究主要檢測了IL28B及其受體IL10RB和IL28RA的多個SNP，分析不同基因型在對照組和病例組中的基因型頻率分布差異，探討基因多態(tài)性與HCV疾病易感性的關(guān)系。IFN-α激活JAK-STAT信號通路，導(dǎo)致超過500多個干擾素刺激基因ISGs的上調(diào)，其中MxA、OAS1和PKR是最明顯的3個基

5、因，可以被干擾素誘導(dǎo)分泌顯著上調(diào)，具有直接抗病毒作用。因此，我們可以檢測外周血單個核細(xì)胞中IL28B及相關(guān)ISGs的mRNA表達(dá)和血清IL28B含量，分析其在HCV感染中可能發(fā)揮的作用，為更詳盡的治療HCV提供分子生物學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　該病例對照研究收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院從2009年11月到2012年4月就診的丙型肝炎患者271例，同期健康體檢者300?；加幸韵录膊〉牟±慌懦谕?乙型肝炎、人類免疫缺陷疾病、

6、其他類型的肝臟疾病，例如自身免疫性肝病、酒精性肝病或者肝臟代謝疾病等。抽取患者2毫升靜脈血，提取基因組DNA，采用高分辨率熔解曲線的方法檢測IL28B單核苷酸多態(tài)性位點(rs12979860，rs8099917，rs12980275，rs11881222)及其受體IL28RA(位點rs11249006)和IL10RB的位點(rs2834167)，分析這6個SNP的基因型和等位基因分布頻率在病例組和對照組之間差異，探討SNP在HCV疾病易

7、感性方面的相關(guān)性。從病例組和對照組中隨機(jī)抽查40個的標(biāo)本，采用直接測序（上海生工）的方法，驗證HRM試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　選取22例HCV-RNA陽性，15例HCV-RNA陰性和45例健康對照樣品，提取外周血單個核細(xì)胞，提取總的RNA，通過RT-PCR的方法檢測IL28B以及相關(guān)ISGs(MxA，OAS1，PKR)的mRNA表達(dá)。收集所有病例組和對照組的血清標(biāo)本，采用ELISA方法檢測IL28B的血清水平，分析IL28B在HCV

8、清除中的作用以及不同基因型之間IL28B的表達(dá)是否存在差異。
　　分組選擇HCV RNA陽性4名，RNA陰性8名和健康對照12名，分離他們的外周血單個核細(xì)胞后，體外刺激培養(yǎng)poly(I∶C)刺激4小時后檢測PBMC中IL28B、MxA和OAS1的mRNA表達(dá)，24小時后檢測上清液中IL28B的蛋白含量，分析其在預(yù)測HCV抗病毒治療應(yīng)答方面的作用。
　　結(jié)果：
　　所有6個SNP對照組的基因型分布頻率均符合HWE(P值大

9、于0.05)，說明對照組可以代表該地區(qū)人群。IL28B的4個SNP基因型分布顯示HCV病例組的雜合子基因型頻率顯著高于對照組，存在顯著性差異(rs1188222 AG基因型OR=2.06，95％CI=1.26-3.37，P=0.00346; rs12979860 CT基因型，OR=2.01,95％CI=1.26-3.37，P=0.00346;rs12980275AG基因型，OR=2.01,95％ CI=1.24-3.35,P=0.003

10、89; rs8099917 GT基因型，OR=2.21,95％CI=1.33-3.68，P=0.00193)。IL10RB的SNP位點rs2834167和L28RA的SNP位點rs11249006位點的基因型和等位基因頻率分布在HCV病例組和對照組沒有顯著差異。單倍型AACT在HCV感染中發(fā)揮保護(hù)性作用，健康對照組中單倍型AACT的頻率顯著高于HCV感染組(OR=1.91,95％CI1.20-3.03，P=0.00551)。
　　

11、健康對照組IL28B的mRNA表達(dá)顯著高于HCV-RNA陽性組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025)。同時各組之間的IL28B血清水平也有顯著性差異，健康對照組最高(68.70±50.26 ng/L)，HCV-RNA陰性組較高(42.03±38.20 ng/L)，HCV-RNA陽性組最低(17.77±5.68 ng/L)。不同IL28B基因型對mRNA的表達(dá)以及血清水平有影響，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。各組中，抗病毒相關(guān)ISGs(MxA，OAS1

12、，PKR)的表達(dá)沒有顯著性差異。
　　體外刺激培養(yǎng)PBMC檢測結(jié)果顯示，HCV病例組的IL28B、MxA和OAS1的mRNA表達(dá)顯著高于健康對照組（P值分別是0.067、0.030和0.006），攜帶保護(hù)性等位基因的個體其mRNA相對表達(dá)較高，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、IL28B基因rs1188222 AG基因型，rs12979860 CT基因型，rs12980275 AG基因型和rs8099917 G

13、T基因型在HCV病例組顯著高于對照組，可能在疾病感染中是危險因素，與HCV疾病易感性相關(guān)。
　　2、IL10RB(rs2834167)和L28RA(rs11249006)位點的基因型和等位基因頻率分布在HCV病例組和對照組沒有顯著差異，未發(fā)現(xiàn)其與HCV疾病易感性之間的關(guān)聯(lián)。
　　3、與健康對照組相比，HCV RNA陽性組的PBMC中IL28B的mRNA相對表達(dá)較低，存在顯著性差異;并且IL28B血清水平也較低，有顯著性差異。

14、IL28B基因編碼干擾素λ，在HCV病毒清除方面發(fā)揮一定的功能。
　　4、IL28基因CC型和CT/TT型個體比較，IL28B的mRNA表達(dá)和血清水平?jīng)]有顯著性差異，單核苷酸多態(tài)性變異對于IL28B的表達(dá)和功能不起決定性作用。
　　5、各組中，相關(guān)干擾素刺激基因MxA、OAS1和PKR的mRNA表達(dá)沒有顯著性差異。
　　6、體外刺激培養(yǎng)PBMC后檢測mRNA的表達(dá)顯示，HCV病例組中IL28B的表達(dá)較高，具有清除HCV