適配子型壓電石英晶體傳感器的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 對(duì)自行研制的壓電石英生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)及其分析軟件進(jìn)行改進(jìn)，并選擇合適的核酸探針固定方法將適配子固定在傳感器金膜表面，以此建立適配子型壓電傳感器陣列，檢測(cè)人免疫球蛋白E，對(duì)適配子型壓電石英傳感器的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行初步探索。 方法 1．利用精細(xì)微加工法制作石英晶體，在其表面光刻金膜電極，石英晶體AT切型、13×13mm、基頻10MHz、金膜電極直徑4.0mm，與檢測(cè)池組裝后形成傳感器檢測(cè)單元，傳感器檢測(cè)單元在檢

2、測(cè)儀上構(gòu)成2×5型拔插式傳感器陣列。頻率記錄分析軟件從PESA-2.0升級(jí)到PESA-4.0，新軟件采用Visual C++語言設(shè)計(jì)，增加多項(xiàng)功能使其更適用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)的需要。對(duì)構(gòu)建好的壓電傳感器檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行氣液相穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及陣列檢測(cè)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。 2．用3，3'-二巰基丙酸自組裝方法將親和素固定在壓電石英晶體傳感器金膜表面，通過壓電石英傳感器頻率變化反映親和素固定效果，比較不同濃度、不同pH 值條件下親和素固定引起的頻率

3、變化，經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行單因素分析選擇最佳固定條件。 3．用巰基固定法及生物素-親和素固定法將針對(duì)人IgE的適配子探針固定在壓電傳感器的金膜表面，通過壓電傳感器對(duì)適配子與IgE的反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，觀察不同濃度IgE的反應(yīng)趨勢(shì)及所引起的頻率變化，經(jīng)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)確定兩種方法的優(yōu)劣。 4．用生物素一親和素法固定IgE適配子對(duì)不同濃度IgE進(jìn)行檢測(cè)，獲得IgE檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以PBS空白對(duì)照三倍標(biāo)準(zhǔn)差反查檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到最低檢

4、出限。通過檢測(cè)BSA、IgG、IgE非特異信號(hào)，并與特異性信號(hào)相比較對(duì)適配子檢測(cè)的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。分別用HCL、NaOH、EDTA、尿素、甲酰胺五種試劑對(duì)適配子芯片進(jìn)行再生實(shí)驗(yàn)，選取較好再生試劑。將固定好的適配子芯片保存在PBS緩沖液(0.1％疊氮鈉)中，對(duì)芯片的保存時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果 1．AT切型石英晶體液相起振能力強(qiáng)、頻率穩(wěn)定適合壓電生物傳感器檢測(cè)要求，傳感器組裝后，氣、液相檢測(cè)穩(wěn)定性好，調(diào)穩(wěn)后10分鐘內(nèi)氣相頻率變

5、化不超過±lHz、液相不超過±2Hz。 2．構(gòu)建的傳感器陣列，單個(gè)傳感器拔插對(duì)陣列中其它傳感器無明顯影響，多通道同時(shí)檢測(cè)穩(wěn)定性好無相互干擾，傳感器陣列穩(wěn)定性達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 3．為了滿足臨床檢測(cè)的需要，新編PESA-4.0軟件增加了如病人信息錄入、歷史結(jié)果查閱、曲線擬合、定標(biāo)等多項(xiàng)功能，其中頻率自動(dòng)更新和圖像編輯等功能的添加對(duì)實(shí)驗(yàn)室研究也有較大幫助。 4．經(jīng)單因素方差分析，磷酸鹽緩沖液pH值為6.2時(shí)親和素固定引起

6、的頻率變化與pH5.8、pH6.6時(shí)并無明顯差異(P>0.05)，但pH值為6.2時(shí)頻率下降有最大均值，應(yīng)用pH7.0、pH7.4溶液進(jìn)行親和素固定時(shí)頻率改變顯著減小(P<0.01)，濃度為0.2 mg/ml時(shí)親和素固定已達(dá)飽和。 5．兩種方法固定適配子對(duì)IgE進(jìn)行檢測(cè)，巰基法明顯不適合于適配子探針固定，表現(xiàn)在對(duì)IgE檢測(cè)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)趨勢(shì)不明顯，低濃度檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)差，線性范圍窄，同濃度檢測(cè)重復(fù)性差；與巰基法相比，經(jīng)優(yōu)化的親和素法

7、對(duì)適配子探針固定效果好，檢測(cè)結(jié)果顯示在上述各個(gè)方面均優(yōu)于巰基法。 6．親和素法固定適配子對(duì)IgE進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出限0.055mg/L，線性范圍0.1-2.5mg/L，非特異性信號(hào)響應(yīng)小，不超過同濃度特異性信號(hào)的5％。用EDTA對(duì)適配子芯片進(jìn)行再生效果最好，重復(fù)檢測(cè)五次后芯片響應(yīng)信號(hào)仍在第一次檢測(cè)的90％以上，此外HCL也可對(duì)適配子芯片重復(fù)利用三次。固定好的適配子芯片在加入防腐劑的結(jié)合緩沖液中可長期保存，保存21天后信號(hào)響應(yīng)無明

8、顯下降。 結(jié)論 1．構(gòu)建的壓電生物傳感器檢測(cè)陣列在液相中起振能力強(qiáng)，多通道檢測(cè)頻率穩(wěn)定相互無影響，可以應(yīng)用于包括適配子在內(nèi)的多種識(shí)別分子檢測(cè)。為臨床檢測(cè)開發(fā)的PESA-4.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)研究也有較大幫助。 2．選用pH 6.2的0.2 mg/ml親和素進(jìn)行壓電石英晶體傳感器金膜修飾效果最好。 3．由于適配子檢測(cè)與普通核酸探針檢測(cè)存在差異，在普通探針固定中效果較好的巰基法明顯不適合于適配子探針固定，生物素