用T7噬菌體展示肽庫篩選肺癌早期檢測分子標志群.pdf

1、安徽醫(yī)科大學碩士學位論文用T7噬菌體展示肽庫篩選肺癌早期檢測分子標志群姓名：陳貽玲申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：鄧松華;曹廣文20090601安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 2 漿 4℃孵育過夜富集抗體。 SDS-PAGE 電泳驗證富集到的抗體后將 20 管肺癌組的抗體及 20 管對照組的抗體各自合并成一管。 （4）肺癌特異性相關肽的富集 ）肺癌特異性相關肽的富集 為了富集可以和肺癌自身

2、抗體特異結合的展示肽， 我們對肺癌 T7 噬菌體展示肽庫進行了正反向的 5 輪親和篩選。取噬菌體擴增液 30μl 用 10%BSA 1:40 稀釋，先與20μl 的對照組抗體 4℃孵育 2 小時，未結合的上清再與 20μl 肺癌組抗體混合 4℃孵育過夜，保留結合到瓊脂糖珠上的噬菌體再擴增，此為一輪篩選，如此反復五輪。每輪篩選后均測定重組率和滴度。 （5）肺癌特異標志物的篩選 ）肺癌特異標志物的篩選 為了找到確實可在臨床上實際應用的肺

3、癌特異標志物， 隨機挑取五輪篩選后的 3000 個噬菌體克隆用 ELISA 方法進一步兩輪篩選。 在酶標儀 450nm 波長下讀取 OD 值。 按下列公式計算并判斷結果：用空白孔調零后，樣品 OD 值／陰性對照平均 OD 值，比值≥2．0，判斷為陽性；樣品 OD 值／陰性對照平均 OD 值，比值<2．0，判斷為陰性。陰性對照 OD 值低于 0.05 作 0.05 計算，高于 0.05 按實際 OD 值計算。肺癌組為陽性、 非肺癌為

4、陰性的噬菌體即為有意義的、 具有診斷肺癌潛能的樣本。 （6）測序和蛋白功能預測）測序和蛋白功能預測 ELISA 篩選出的噬菌體克隆，測序后經過 NCBI 上的BLAST 序列比對找到完全一致或者最接近的已知基因序列，推測我們獲得的基因的是否與癌癥相關。 【結果】 【結果】 （1）構建成原始文庫的庫容量為 5.4×106 pfu/ml，重組率為 60%. 擴增庫的滴度為 9.6×108pfu/ml。（2）五輪親和篩選

5、后噬菌體肽庫的重組率和滴度均有了很大的提高， 反映出具有某些特征的噬菌體得到了富集。 （3） 重復兩輪 ELISA共篩選出 13 個有意義的噬菌體。其測序結果獲得后，其中 1 個為未知其功能的新基因（817 號和 1525 號為同一未知功能的新基因） ，其余的均有報道與癌癥相關，且這 13 個基因中包含三組相同的基因。 【結論】 結論】 （1）T7 噬菌體構建的 cDNA 文庫可以很好的展示各種小豐度蛋白。 （2）經過五輪親和篩選表達肺