展示豬O型口啼疫病毒中和表位的重組T7噬菌體研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是國際獸疫局(OIE)規(guī)定的A類傳染病。在我國，該疫病危害位于重大動物疫病之首，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研制安全、高效的口蹄疫新型疫苗具有十分重要的意義。VP1是FMDV最重要的抗原，它包含連續(xù)性線性B細(xì)胞抗原表位（G-H環(huán)），該表位可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體，是研制口蹄疫新型表位疫苗的首選靶標(biāo)。
　　 T7噬

2、菌體展示系統(tǒng)(T7 phage display)是近年來發(fā)展起來的一種優(yōu)秀的新型多肽展示技術(shù)。該系統(tǒng)展示效率為415拷貝/粒子，T7噬菌體增殖迅速、制備成本低，是十分理想的B細(xì)胞表位展示載體。
　　 本文成功構(gòu)建出展示FMDV G-H環(huán)的T7噬菌體，對重組噬菌體的生物學(xué)特性及免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，為研制口蹄疫新型表位疫苗打下良好基礎(chǔ)。全文的主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.重組噬菌體的構(gòu)建
　　 在分析、比對我國

3、近年豬O型口蹄疫流行毒株VP1氨基酸序列的基礎(chǔ)上，確定了G-H環(huán)共有序列。根據(jù)T7噬菌體密碼偏嗜性進(jìn)行基因序列優(yōu)化，化學(xué)合成G-H環(huán)基因。將該基因插入T7 Select415-1b載體中，經(jīng)過包裝蛋白體外包裝拯救，獲得重組噬菌體。用噬斑PCR及序列測定方法，篩選陽性重組噬菌體，重組噬菌體經(jīng)過擴(kuò)增、濃縮、純化，用SDS-PAGE檢測目標(biāo)表位的表達(dá)，用Western-blotting確定目標(biāo)表位的免疫原活性。結(jié)果表明，我們已成功地獲得了重組

4、噬菌體，目的基因序列插入正確、閱讀框無移碼，展示表達(dá)的目標(biāo)表位分子量為41kD，與理論值相符，該多肽與特異性抗體具有良好的結(jié)合活性。
　　 2.重組噬菌體的生物學(xué)特性研究
　　 獲得重組菌噬菌體后，對其生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為規(guī)模制造抗原奠定基礎(chǔ)。重組噬菌體的生物學(xué)特性研究包括噬菌體增殖條件，最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)和一步生長曲線;重組噬菌體的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和傳代穩(wěn)定性等。結(jié)果表明，重組噬菌體最適增殖溫度是37

5、℃，最佳感染復(fù)數(shù)是10-4～10-5。重組噬菌體形成圓形噬斑，透明、邊界清晰，直徑為0.8～2.3mm。增殖液中添加Mg2+10 mmol/L或Ca2+5 mmol/L，重組噬菌體產(chǎn)量提高20％。重組噬菌體感染宿主后潛伏期為30min，爆發(fā)時(shí)間為150min，子代產(chǎn)量為126pfu/細(xì)胞。重組噬菌體具有良好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和傳代穩(wěn)定性，重組噬菌體毒種用20％甘油可長期4℃保存，非常適用于疫苗制造。
　　 3.重組噬菌體的

6、免疫原性研究
　　 將純化的重組噬菌體懸液與206佐劑按54∶46比例混合，制備出實(shí)驗(yàn)用疫苗，免疫幼齡仔豬，測試其免疫效力。實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)分為三組，每組5頭。實(shí)驗(yàn)組頸部肌肉注射實(shí)驗(yàn)重組噬菌體疫苗1O11pfu/ml/頭，陽性對照組注射市售豬O型口蹄疫合成肽疫苗1ml/頭，同時(shí)設(shè)立不免疫空白對照組。共免疫注射2次，一免后2周加強(qiáng)免疫，每次免疫前及二免后兩周前腔靜脈采血，分離血清。應(yīng)用豬O型口蹄疫合成肽ELISA試劑盒和液相阻斷ELIS