重癥失血性休克大鼠的外周血血小板線粒體的變化及虎杖苷的干預(yù)作用.pdf

1、重癥難治性休克(Severe irreversible shock)是指休克的晚期，經(jīng)過輸血補液和各種改善微循環(huán)為主的抗休克治療以后，病情仍然惡化，發(fā)生死亡。已有報告線粒體病變參與了休克、感染、膿毒癥時多器官功能不全(MODS)的發(fā)生。另外在重癥休克研究中，已證實平滑肌線粒體發(fā)生了損傷，它帶來了ATP生成減少。表現(xiàn)為線粒體腫脹，膜嵴排列紊亂，通透性轉(zhuǎn)變孔開放，線粒體膜電位（△ψm）減低，治療后小動脈血管平滑肌細胞(Arterial sm

2、ooth muscle cells，ASMCs)內(nèi)ATP仍明顯減少，線粒體保護劑（CsA、虎杖苷）有一定治療作用，提示細胞線粒體的功能與休克之間存在著密切的關(guān)系。但血小板線粒體功能與膿毒癥的轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系有不同的報道，有人報道血小板線粒體呼吸暫時性增強與膿毒癥病人的預(yù)后呈負相關(guān)，而另有人報道血小板線粒體細胞色素C氧化酶活性在膿毒血癥死亡組病人中下降得更為顯著。本項研究欲查明重癥休克大鼠血小板是否發(fā)生線粒體損傷，休克不同時間、程度時線粒體

3、損傷是否存在差別，能否根據(jù)線粒體損傷程度推斷出休克輕重程度，及保護線粒體后血小板線粒體變化，為臨床重癥休克的診斷和治療提出新思路。為此本實驗利用重癥失血性休克模型，設(shè)立休克不同時間，造成不同休克程度，以及休克再輸血治療組，采用ATP含量測定，透射電鏡觀察，線粒體膜電位檢測，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔狀態(tài)檢測，過氧化脂質(zhì)的檢測以及溶酶體穩(wěn)定性的檢測等方法分析線粒體功能狀態(tài)，探討休克時間及程度與線粒體功能的關(guān)系。
　　 方法:
　　

4、 SPF級Wistar大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重（200±20g）隨機分六組:假手術(shù)組，休克30min，60min，120min組，休克120min+生理鹽水+輸血組(NS組)，休克120min+虎杖苷+輸血組（PD組）。用我室已建立的重癥失血性休克模型，大鼠用麻藥（由13.3％烏拉坦和0.5％氯醛糖溶于100ml生理鹽水中配置而成）肌肉注射（0.65ml/kg）麻醉。雙側(cè)動脈及單側(cè)靜脈插管，動脈插管用來放血以及監(jiān)測平均

5、動脈壓(MAP)，靜脈插管則用來液體回輸。假手術(shù)組:進行動靜脈插管等手術(shù)，但不復(fù)制休克模型，作為陰性對照。休克組，將大鼠快速放血（10分鐘內(nèi)）使血壓降至30mmHg左右分別維持30，60，120min。PD組，為休克維持120min后靜脈給虎杖苷（30mg/kg）0.6ml，5min后輸回全血，觀察120min。NS組，為休克維持120min后靜脈給與虎杖苷等同體積的生理鹽水，5min后輸回全血，觀察120min。以上各組血液均用注射器

6、收集并用肝素抗凝。模型結(jié)束后，各組大鼠均采用腹主動脈插管取血，50UI/ml肝素化。所取血液用Percoll梯度密度離心法分離血小板。各組血小板制作成電鏡標(biāo)本后用透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化;用熒光素—熒光素酶試劑盒來檢測血小板線粒體ATP水平;用血小板內(nèi)Calcein熒光強度判斷血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔狀態(tài);采用JC-1探針來檢測細胞線粒體跨膜電位(△ψm)的變化，用發(fā)射的綠色熒光的JC-1單體（低△ψm細胞）的細胞百分?jǐn)?shù)(％)來說

7、明血小板線粒體去極化比例;使用過氧化氫脂質(zhì)(LPO)分析試劑盒檢測血小板中的過氧化脂質(zhì)含量;血小板溶酶體穩(wěn)定性通過吖啶橙(Acridine Orange，AO)檢測，用“蒼白”細胞(Palecells)的百分比來說明血小板溶酶體狀態(tài)以及用細胞紅色熒光的強弱判斷溶酶體穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:
　　 1.血小板線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生腫脹破壞
　　 透射電鏡結(jié)果顯示，隨著休克時間的加長，休克程度的加深，線粒體腫脹愈發(fā)嚴(yán)重:假手術(shù)

8、組，大鼠血小板線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)致密，內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)完整;休克30min組，線粒體發(fā)生部分腫脹，基質(zhì)電子密度降低;休克60min組，線粒體腫脹加重，嵴斷裂，基質(zhì)電子密度降低;休克120min組線粒體腫脹越發(fā)明顯，嵴斷裂，出現(xiàn)電子透亮區(qū)和線粒體空泡; NS治療組線粒體腫脹明顯，嵴斷裂，出現(xiàn)線粒體空泡;PD治療組線粒體有一定程度的腫脹，但嵴結(jié)構(gòu)相對完整。
　　 2.血小板內(nèi)ATP含量明顯下降
　　 與假手術(shù)組相比，休克6

9、0min，120min及NS組血小板線粒體的ATP水平發(fā)生顯著性的減少，在休克120min時僅為假手術(shù)組的63.84±8.51％(P=0.000)，生理鹽水治療后為50.75±9.15％(P=0.000)。PD組血小板ATP水平為假手術(shù)組的79.57±8.48％(P=0.011)，顯著高于休克120min組(P=0.045)及NS治療組（P=0.001）。提示隨著休克時間增加，休克程度加深，血小板線粒體功能受損加深，給予虎杖苷保護后，血

10、小板線粒體受損程度減輕。
　　 3.血小板線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放
　　 血小板線粒體Calcein-AM及Co2+共染熒光共聚焦結(jié)果顯示，隨著休克時間延長，線粒體鈣黃綠素?zé)晒庵饾u減弱，流式結(jié)果同樣顯示隨著休克時間延長，大鼠血小板中線粒體鈣黃綠素?zé)晒庵饾u減弱，休克60min，120min以及NS組血小板的鈣黃綠素?zé)晒鈴姸确謩e為197.20±56.15，175.16±58.33，165.09±1.44AU較假手術(shù)組（323.

11、60±46.51AU）顯著減弱（P=0.000，P=0.000，P=0.000）。PD組血小板Calcein-AM熒光（234.76±40.97AU）顯著高于NS組(P=0.008)，這說明虎杖苷減少休克時血小板線粒體通透轉(zhuǎn)變孔的開放。
　　 4.血小板線粒體內(nèi)膜跨膜電位降低
　　 用流式細胞儀檢測熒光探針JC-1標(biāo)記的血小板線粒體膜電位△ψm的改變，計數(shù)低△ψm細胞（JC-1單體，發(fā)綠色熒光）的含量。休克30min時低

12、△ψm細胞含量為23.85±6.05％，與假手術(shù)組（11.72±4.43％）相比顯著增多(P=0.003)，休克60min，120min時低△ψm細胞含量分別為32.40±3.27％，37.00±9.97％，提示在休克30min時就已經(jīng)出現(xiàn)血小板線粒體膜電位去極化，而且隨著休克時間增加和休克程度加深，去極化增多。PD治療組中低△ψm細胞含量為16.09±4.50％，較NS治療組（34.13±7.72％）顯著減少(P=0.000)，虎杖苷

13、減少休克時血小板線粒體內(nèi)膜跨膜電位的降低。
　　 5.血小板中過氧化脂質(zhì)的含量增高
　　 單純休克30，60，120min時血小板中過氧化脂質(zhì)含量與假手術(shù)組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.848，P=0.875，P=0.951）。NS組血小板中過氧化脂質(zhì)含量由假手術(shù)組3.06±0.42nmol/1.0×108增至4.33±1.09 nmol/1.0×108顯著高于假手術(shù)組(P=0.006)。PD組血小板中過氧化脂質(zhì)含量顯著少

14、于NS組(P=0.007)。提示在缺血性休克過程中，過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生并沒有顯著改變，在回輸血再灌注后則大量產(chǎn)生。給予虎杖苷保護后，減少了過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生。
　　 6.血小板溶酶體穩(wěn)定性的下降
　　 血小板AO染色，共聚焦結(jié)果顯示隨著休克時間延長，熒光減弱，流式結(jié)果提示休克30min，60min，120min組以及NS組溶酶體受損細胞(Pale cells)含量分別為8.30±2.45、19.96±2.95、22.68±3

15、.37％，較假手術(shù)組（3.97±0.62％）有顯著增多(P=0.011，P=0.000，P=0.000)，隨著休克時間延長，溶酶體受損細胞含量增多。PD組中溶酶體受損細胞含量為7.12±2.90％與NS組（21.35±1.44％）相比，溶酶體受損細胞顯著減少(P=0.000)，說明虎杖苷改善休克時血小板溶酶體膜穩(wěn)定性。
　　 7.各組大鼠體重、放血量、平均動脈壓情況
　　 各組大鼠體重以及基礎(chǔ)平均動脈壓無統(tǒng)計學(xué)差異（P=

16、0.223，P=0.402）。休克2h組，NS組，PD組的放血量，補血時間，補血量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.669，P=0.821，P=0.997)。在給藥回輸血治療30min后，NS組，PD組的平均動脈壓(MAP)分別為51.40±10.80mmHg，71.06±5.73 mmHg，二者有統(tǒng)計學(xué)差異（t=-3.937，P=0.003），PD組MAP高于NS組，隨著觀察時間增加，二者MAP差異越大，到回輸血后120min，NS組，PD組的M

17、AP分別為41.57±11.34，90.67±10.46mmHg，二者有顯著性差異(t=-7.797，P=0.003)
　　 結(jié)論:
　　 1.大鼠休克60min時，血小板ATP合成顯著減少(P=0.002)，ATP含量隨著休克時間增加而減少，在休克120min+生理鹽水+輸血組中最為嚴(yán)重，為正常值的50.75±9.15％。
　　 2.在休克30min時就出現(xiàn)線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊消失，線粒體膜電位(△ψm)下降

18、，以及溶酶體穩(wěn)定性下降（蒼白細胞增多）;休克60min時鈣黃綠素?zé)晒鉁p弱(P=0.000)，這些都提示微循環(huán)紊亂和線粒體功能不全共同導(dǎo)致血小板ATP水平下降。而在休克120min+虎杖苷+輸血組中，上述各指標(biāo)都有所改善，特別是血小板ATP水平恢復(fù)到正常值的約80％。
　　 3.重癥休克血小板線粒體合成ATP功能減弱的機制包括:自由基脂質(zhì)過氧化和溶酶體受損（在休克30min時即出現(xiàn)），線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放（休克60min時即出現(xiàn)）