線粒體損傷在重癥休克中作用及虎杖苷治療.pdf

1、重癥休克患者有很高的死亡率，在輸血補液等一般抗休克治療后生命仍難以糾正。導致重癥休克高死亡的原因很復雜，目前仍然不清楚，因此查明導致高死亡率的發(fā)病機制對臨床上指導重癥休克的治療具有重要的意義。我們的前期實驗證實，血管平滑肌細胞(ASMCs) ATP含量下降，激活A(yù)TP敏感性鉀通道，促使細胞膜超極化和L型鈣通道抑制，導致血管對去甲腎上腺素的反應(yīng)性下降和頑固性低血壓。在這種急性重癥休克條件下（失血到MAP30mmHg2小時，回輸血液2小時）

2、，除了微循環(huán)障礙帶來血管平滑肌細胞(ASMCs)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足以外，還查明血管平滑肌細胞線粒體損傷帶來ATP的合成障礙引起低血管反應(yīng)性和頑固性低血壓。
　　 重癥休克是一個全身性缺血-再灌注損傷，它導致線粒體器質(zhì)性損傷可能是急性休克晚期一個體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，參與了重癥休克難治期（微循環(huán)衰竭期）的發(fā)生。為了證實以上設(shè)想，本研究對重癥休克大鼠的血管平滑肌細胞、大腦神經(jīng)元和肝細胞的線粒體功能進行了系列研究，從線粒體結(jié)構(gòu)、功能

3、、代謝及損傷機制方面查明線粒體功能不全在重癥休克發(fā)病中的作用。
　　 本研究的另一個目的是查明新的線粒體保護劑，并使用線粒體保護劑從實驗治療的角度，確證線粒體損傷在重癥休克發(fā)生中的作用。白藜蘆醇和環(huán)孢霉素A是國際公認的線粒體保護劑。白藜蘆醇通過螯合氧化反應(yīng)所需的二價鐵抑制氧化應(yīng)激，又能夠抑制線粒體復合物Ⅲ減少氧自由基生成，發(fā)揮保護線粒體的作用。和白藜蘆醇一樣，環(huán)孢霉素A通過作用于親環(huán)素D抑制線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放發(fā)揮保護線粒體的作

4、用?；⒄溶?Polydatin，PD)的化學名稱是白藜蘆醇苷（白藜蘆醇結(jié)合了一個分子的葡萄糖），因此虎杖苷很有可能具有線粒體保護的作用。本研究一方面用三種線粒體保護劑的保護效應(yīng)進行相互比較，另一方面用三種臟器細胞的變化與全身休克搶救效果相互對照，查明線粒體保護劑對重癥休克治療的重要性，為臨床重癥休克的治療提供新途經(jīng)。
　　 第一部分血管平滑肌線粒體功能不全在重癥休克中的作用
　　 一、重癥休克時血管平滑肌細胞發(fā)生了線粒體

5、損傷
　　 1.重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷:透射電鏡結(jié)果顯示假手術(shù)組血管平滑肌細胞線粒體呈現(xiàn)橢圓狀，嵴結(jié)構(gòu)完整，但是在休克組線粒體呈圓球狀，嵴斷裂空泡化，明顯腫脹，提示重癥休克時血管平滑肌細胞細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷。
　　 2.重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體內(nèi)膜跨跨膜電位降低:采用JC-1熒光探針流式細胞儀測定線粒體跨膜電位。休克組線粒體去極化的血管平滑肌細胞為80.34±9.01％，明顯高于假手術(shù)組的1

6、3.44±7.73％(P=0.000)，提示重癥休克時血管平滑肌細胞可能存在線粒體質(zhì)子泵功能損傷或通透轉(zhuǎn)變孔開放，帶來跨膜離子梯度的下降。
　　 3.重癥休克時血管平滑肌細胞ATP含量降低:休克組血管平滑肌細胞ATP含量降低到正常水平（假手術(shù)組）的17.61±7.87％(P=0.000)，提示重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體功能不全。
　　 4.重癥休克時血管平滑肌細胞膜KATP的激活和細胞超極化:休克組血管平滑肌細胞膜K

7、ATP電流相對假手術(shù)組顯著增加，在電壓為+80 mV時，KATP電流密度由假手術(shù)組的7.0±2.2pA/pF增加到休克組的15.7±7.3 pA/pF(P=0.001)，提示重癥休克時血管平滑肌細胞ATP含量降低。和KATP的變化一樣，細胞跨膜電位由假手術(shù)組的-31.7±5.3 mV增加到休克組的-49.7±5.3 mV（P=0.000），顯示重癥休克時血管平滑肌細胞超極化。
　　 5.重癥休克時血管平滑肌細胞過氧化脂質(zhì)(LPO

8、)含量增加:實驗結(jié)果顯示血管平滑肌細胞過氧化脂質(zhì)從假手術(shù)組的10.01±1.56 nmol升高到休克組的15.00±2.23 nmol(P=0.000)，提示重癥休克時血管平滑肌細胞內(nèi)氧自由基激活。
　　 6.重癥休克時血管平滑肌細胞溶酶體膜穩(wěn)定性降低:采用吖叮橙攝取技術(shù)評價溶酶體穩(wěn)定性。休克組血管平滑肌細胞溶酶體吖叮橙熒光顯著低于假手術(shù)組，提示重癥休克時血管平滑肌細胞溶酶體膜通透。流式細胞儀定量分析結(jié)果顯示休克組“蒼白細胞”（

9、溶酶體受損的細胞）由假手術(shù)組的28.27±5.19％增加到51.6±4.8％(P=0.000)，提示重癥休克時大量的血管平滑肌細胞存在溶酶體損傷。
　　 7.重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放:采用鈣黃綠素—氯化鈷技術(shù)，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)休克組血管平滑肌細胞線粒體熒光顯著低于假手術(shù)組。流式細胞儀分析結(jié)果顯示血管平滑肌細胞線粒體熒光由假手術(shù)組的156.6±11.8降低到休克組的48.8±7.1（P=0.000），提示重

10、癥休克時血管平滑肌細胞線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放，可能伴隨線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷。
　　 綜上所述，重癥休克通過氧化應(yīng)激誘導的溶酶體-線粒體軸引起血管平滑肌細胞線粒體損傷。我們查明此時血管平滑肌細胞缺氧，不僅與微循環(huán)障礙有關(guān)，還可能存在細胞病性缺氧，本質(zhì)是線粒體損傷，因此保護線粒體可能是重癥休克治療的一個新靶點。
　　 二、查明新的線粒體保護劑-虎杖苷對血管平滑肌細胞的保護效應(yīng)
　　 在3種保護劑中，環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇

11、和虎杖苷不同程度地抑制重癥休克引起的線粒體腫脹等結(jié)構(gòu)破壞，其中虎杖苷的保護效果最顯著，線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復正常;在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，線粒體去極化的血管平滑肌細胞由休克組的80.34±9.01％分別降低到為75.38±18.33％、53.69±17.10％和31.57±6.12％，同時血管平滑肌細胞ATP含量由休克組正常水平的17.61±7.89％分別增加到32.69±5.45％、62.12±11.49％和90.71±7.

12、47％;在3種線粒體保護劑治療后重癥休克激活的KATP得到部分抑制，其中虎杖苷效果最顯著，在電壓鉗制在+80 mV時，休克虎杖苷治療組電流密度由休克組的15.7±7.3 pA/pF減少至9.4±4.2pA/pF。和KATP的變化一樣，休克虎杖苷治療組的細胞跨膜電位由休克組的-49.7±5.3 mV降低到的-36.9±7.2 mV;在3種保護劑治療后血管平滑肌細胞LPO含量均有下降，其中在休克虎杖苷治療組下降程度最顯著，由休克組的15.0

13、0±2.23 nmol降低到10.42±0.99 nmol（P=0.000）;3種線粒體保護劑抑制了重癥休克時血管平滑肌細胞溶酶體紅色吖叮橙熒光和線粒體綠色鈣黃綠素熒光強度減弱，其中虎杖苷作用效果最顯著，在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，“蒼白細胞”由休克組的51.63±4.77％，分別減少到42.05±2.81％、47.46±3.06％和36.85±3.84％，同時血管平滑肌細胞線粒體綠色鈣黃綠素熒光由休克組48.8±7.1恢復到

14、環(huán)孢霉素A治療組的59.7±13.4，白藜蘆醇治療組的62.3±24.8和虎杖苷治療組的79.6±8.6?？傊?，3種線粒體保護劑通過抑制重癥休克時氧化應(yīng)激和隨后的溶酶體膜通透及線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放發(fā)揮了保護血管平滑肌細胞線粒體的作用，其中虎杖苷作用效果最強，血管平滑肌細胞內(nèi)的ATP含量增加到正常水平的90.71±7.47％。因此虎杖苷是重癥休克治療中理想的線粒體保護劑。
　　 第二部分大鼠多臟器實質(zhì)細胞線粒體在重癥休克中發(fā)生的變

15、化
　　 重癥休克時，血管平滑肌細胞、神經(jīng)元和肝細胞發(fā)生線粒體損傷。1.重癥休克時線粒體有類似的形態(tài)學改變，即線粒體腫脹，嵴排列紊亂，斷裂呈空泡，基質(zhì)低電子密度，提示重癥休克誘導多臟器線粒體結(jié)構(gòu)破壞。2.細胞內(nèi)ATP含量降低，以血管平滑肌細胞最為顯著，ATP含量降低到正常水平的17.61±7.87％，提示重癥休克時多臟器線粒體功能不全。3.線粒體跨跨膜電位降低，提示重癥休克時多臟器線粒體電子傳遞鏈功能不全和線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放。

16、4.有類似的發(fā)病過程，即LPO含量和“蒼白”細胞增加，線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放，提示氧化應(yīng)激誘導的溶酶體損傷和隨后的線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放參與了重癥休克時多臟器線粒體損傷。
　　 第三部分線粒體保護劑對重癥休克線粒體的保護作用
　　 一、線粒體保護劑抑制了重癥休克線粒體結(jié)構(gòu)損傷:在線粒體保護劑治療后，3種細胞（血管平滑肌細胞、神經(jīng)元和肝細胞）線粒體腫脹減輕，嵴斷裂減少，基質(zhì)電子密度增加，提示線粒體保護劑抑制重癥休克誘導的線粒體

17、結(jié)構(gòu)損傷，在虎杖苷治療組最為顯著，線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復正常。
　　 二、線粒體保護劑抑制重癥休克線粒體跨膜電位降低:在3種線粒體保護劑治療后，線粒體去極化的細胞在血管平滑肌細胞由休克組的80.34±9.01％，分別降低到75.38±18.33％、53.69±17.10％和31.57±6.12％，在神經(jīng)元由休克組的65.86±10.88％，分別降至59.46±8.23％、56.32±13.70％和26.22±7.73％，在肝細胞分別

18、由休克組的37.21±4.98％分別降至23.09±4.06％、25.12±3.31％和12.49±3.06％，提示線粒體保護劑可能抑制了重癥休克誘導的線粒體電子傳遞鏈損傷和通透轉(zhuǎn)變孔開放，其中虎杖苷作用效果明顯優(yōu)于環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇。
　　 三、線粒體保護劑改善了重癥休克線粒體ATP合成功能:在3種線粒體保護劑治療后，細胞內(nèi)ATP含量在血管平滑肌細胞由休克組正常水平的17.61±7.89％分別增加到32.69±5.45％、6

19、2.12±11.49％和90.71±7.47％，在神經(jīng)元由正常水平的44.14±13.81％升高到正常水平（假手術(shù)組）的54.93±13.79％、63.74±16.06％和89.57±9.21％，在肝細胞由休克組正常水平的48.84±3.84％分別增加地正常水平（假手術(shù)組）的63.03±6.81％，57.56±7.08％，87.17±17.29％，提示線粒體保護劑顯著改善了重癥休克時3種細胞線粒體功能，尤其是虎杖苷，在3種線粒體保護劑治

20、療組中虎杖苷治療組具有最佳的ATP含量。
　　 四、線粒體保護劑降低了重癥休克LPO含量:3種線粒體保護劑治療后，細胞內(nèi)的LPO含量過氧化脂質(zhì)含量出現(xiàn)不同程度的下降，其中休克虎杖苷治療組下降最顯著，在血管平滑肌細胞由休克組正常水平的149.85±22.27％下降到假手術(shù)組的104.00±9.89％，在神經(jīng)元由休克組正常水平的139.93±17.67％降低到正常水平的102.25±9.43％，在肝細胞由正常水平的211.87±21

21、.05％降低到正常水平（假手術(shù)組）的102.78±19.61％，提示虎杖苷顯著抑制了重癥休克誘導的氧化應(yīng)激和隨后的溶酶體和線粒體損傷。
　　 五、線粒體保護劑改善了重癥休克溶酶體穩(wěn)態(tài):在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，“蒼白細胞”減少，其中虎杖苷治療組減少最顯著，在血管平滑肌細胞由休克組的51.63±4.77％減少到36.85±3.84％，在神經(jīng)元由休克組的18.89±2.03％減少到10.12±1.00％，在肝細胞由休克組

22、的30.14±5.73％減少到5.79±1.28％，提示虎杖苷可以顯著降低重癥休克誘導的溶酶體膜通透。
　　 六、線粒體保護劑抑制了重癥休克線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放:在線粒體保護劑（環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷）治療后，線粒體鈣黃綠素熒光出現(xiàn)不同程度的恢復，其中虎杖苷的作用效果最明顯，在血管平滑肌細胞細胞由休克組正常水平的31.16±0.05％增加到50.83±5.49％，在神經(jīng)元由休克組正常水平的60.37±10.06％增加到正常

23、水平的91.32±18.57％，在肝細胞由休克組正常水平的23.68±2.41％恢復到46.69±2.89％，提示虎杖苷有效地抑制了重癥休克誘導的線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放。
　　 七、線粒體保護劑改善了重癥休克的血管反應(yīng)性、血壓:休克大鼠在經(jīng)輸血給藥治療2小時后，休克組去甲腎上腺素閾值增加到失血前的29.3倍，平均動脈壓降至47.23±11.28 mmHg;在環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇治療組，去甲腎上腺素閾值分別降至失血前的10.4倍和1

24、1.8倍，同時平均動脈壓升至55.23±9.92 mmHg和57.10±15.74 mmHg;但是在虎杖苷治療組去甲腎上腺素閾值為失血前的4.8倍，平均動脈壓為89.38±16.31 mmHg，提示線粒體保護劑不同程度地糾正了重癥休克血管低反應(yīng)性和頑固性低血壓，其中虎杖苷的作用效果最顯著。
　　 八、線粒體保護劑降低重癥休克大鼠大腦皮層NADH水平:在輸血再灌2小時末，休克組大鼠大腦皮層NADH水平相當失血前增加了38.58±6

25、.52％，提示重癥休克大鼠大腦皮層線粒體電子傳遞鏈功能障礙。在3種線粒體保護劑中，只有虎杖苷治療組大腦皮層NADH水平明顯降低，降低到15.03±3.06％，提示虎杖苷改善了重癥休克大鼠大腦皮層線粒體電子傳遞鏈功能。
　　 九、線粒體保護劑延長了重癥休克大鼠的存活時間:休克組大鼠存活時間僅僅為5.4±2.6h，24小時存活率為0;環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇治療后，存活時間分別延長了2.05倍和1.95倍，但24小時存活率仍然為0;在虎

26、杖苷治療組大鼠存活時間延長至休克組的4.35倍，24小時存活率顯著提高到5/8，提示虎杖苷顯著延長休克大鼠存活時間。
　　 綜上所述，線粒體保護劑通過抑制重癥休克時氧化應(yīng)激和隨后發(fā)生的溶酶體膜通透及線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開放發(fā)揮了保護多臟器線粒體的作用，糾正重癥休克頑固性低血壓和血管低反應(yīng)性，延長重癥休克大鼠的存活時間，提示采用線粒體保護劑保護多臟器線粒體成為重癥休克治療的新療法，其中虎杖苷作用效果最顯著，休克虎杖苷治療組大鼠的存活時

27、間由休克組的5.4±2.6 h延長到23.7±3.7 h，24小時存活率延長到5/8。因此，使用虎杖苷保護線粒體是重癥休克治療的理想選擇，為臨床重癥休克治療提供了新思路。
　　 結(jié)論：
　　 1.重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體參與了重癥休克頑固性低血壓和低血管反應(yīng)性的發(fā)生，最終導致重癥休克高死亡率和難治性。
　　 2.查明重癥休克時血管平滑肌細胞線粒體損傷與氧化應(yīng)激誘導的溶酶體-線粒體軸有關(guān)。
　　 3.