線粒體損傷在重癥休克中作用及虎杖苷治療.pdf

1、重癥休克患者有很高的死亡率，在輸血補(bǔ)液等一般抗休克治療后生命仍難以糾正。導(dǎo)致重癥休克高死亡的原因很復(fù)雜，目前仍然不清楚，因此查明導(dǎo)致高死亡率的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床上指導(dǎo)重癥休克的治療具有重要的意義。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞(ASMCs) ATP含量下降，激活A(yù)TP敏感性鉀通道，促使細(xì)胞膜超極化和L型鈣通道抑制，導(dǎo)致血管對(duì)去甲腎上腺素的反應(yīng)性下降和頑固性低血壓。在這種急性重癥休克條件下（失血到MAP30mmHg2小時(shí)，回輸血液2小時(shí)）

2、，除了微循環(huán)障礙帶來(lái)血管平滑肌細(xì)胞(ASMCs)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足以外，還查明血管平滑肌細(xì)胞線粒體損傷帶來(lái)ATP的合成障礙引起低血管反應(yīng)性和頑固性低血壓。
　　 重癥休克是一個(gè)全身性缺血-再灌注損傷，它導(dǎo)致線粒體器質(zhì)性損傷可能是急性休克晚期一個(gè)體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，參與了重癥休克難治期（微循環(huán)衰竭期）的發(fā)生。為了證實(shí)以上設(shè)想，本研究對(duì)重癥休克大鼠的血管平滑肌細(xì)胞、大腦神經(jīng)元和肝細(xì)胞的線粒體功能進(jìn)行了系列研究，從線粒體結(jié)構(gòu)、功能

3、、代謝及損傷機(jī)制方面查明線粒體功能不全在重癥休克發(fā)病中的作用。
　　 本研究的另一個(gè)目的是查明新的線粒體保護(hù)劑，并使用線粒體保護(hù)劑從實(shí)驗(yàn)治療的角度，確證線粒體損傷在重癥休克發(fā)生中的作用。白藜蘆醇和環(huán)孢霉素A是國(guó)際公認(rèn)的線粒體保護(hù)劑。白藜蘆醇通過(guò)螯合氧化反應(yīng)所需的二價(jià)鐵抑制氧化應(yīng)激，又能夠抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ減少氧自由基生成，發(fā)揮保護(hù)線粒體的作用。和白藜蘆醇一樣，環(huán)孢霉素A通過(guò)作用于親環(huán)素D抑制線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放發(fā)揮保護(hù)線粒體的作

4、用?；⒄溶?Polydatin，PD)的化學(xué)名稱(chēng)是白藜蘆醇苷（白藜蘆醇結(jié)合了一個(gè)分子的葡萄糖），因此虎杖苷很有可能具有線粒體保護(hù)的作用。本研究一方面用三種線粒體保護(hù)劑的保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行相互比較，另一方面用三種臟器細(xì)胞的變化與全身休克搶救效果相互對(duì)照，查明線粒體保護(hù)劑對(duì)重癥休克治療的重要性，為臨床重癥休克的治療提供新途經(jīng)。
　　 第一部分血管平滑肌線粒體功能不全在重癥休克中的作用
　　 一、重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了線粒體

5、損傷
　　 1.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷:透射電鏡結(jié)果顯示假手術(shù)組血管平滑肌細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)橢圓狀，嵴結(jié)構(gòu)完整，但是在休克組線粒體呈圓球狀，嵴斷裂空泡化，明顯腫脹，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷。
　　 2.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜跨跨膜電位降低:采用JC-1熒光探針流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體跨膜電位。休克組線粒體去極化的血管平滑肌細(xì)胞為80.34±9.01％，明顯高于假手術(shù)組的1

6、3.44±7.73％(P=0.000)，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞可能存在線粒體質(zhì)子泵功能損傷或通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，帶來(lái)跨膜離子梯度的下降。
　　 3.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞ATP含量降低:休克組血管平滑肌細(xì)胞ATP含量降低到正常水平（假手術(shù)組）的17.61±7.87％(P=0.000)，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體功能不全。
　　 4.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞膜KATP的激活和細(xì)胞超極化:休克組血管平滑肌細(xì)胞膜K

7、ATP電流相對(duì)假手術(shù)組顯著增加，在電壓為+80 mV時(shí)，KATP電流密度由假手術(shù)組的7.0±2.2pA/pF增加到休克組的15.7±7.3 pA/pF(P=0.001)，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞ATP含量降低。和KATP的變化一樣，細(xì)胞跨膜電位由假手術(shù)組的-31.7±5.3 mV增加到休克組的-49.7±5.3 mV（P=0.000），顯示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞超極化。
　　 5.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO

8、)含量增加:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血管平滑肌細(xì)胞過(guò)氧化脂質(zhì)從假手術(shù)組的10.01±1.56 nmol升高到休克組的15.00±2.23 nmol(P=0.000)，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基激活。
　　 6.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性降低:采用吖叮橙攝取技術(shù)評(píng)價(jià)溶酶體穩(wěn)定性。休克組血管平滑肌細(xì)胞溶酶體吖叮橙熒光顯著低于假手術(shù)組，提示重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞溶酶體膜通透。流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果顯示休克組“蒼白細(xì)胞”（

9、溶酶體受損的細(xì)胞）由假手術(shù)組的28.27±5.19％增加到51.6±4.8％(P=0.000)，提示重癥休克時(shí)大量的血管平滑肌細(xì)胞存在溶酶體損傷。
　　 7.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放:采用鈣黃綠素—氯化鈷技術(shù)，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)休克組血管平滑肌細(xì)胞線粒體熒光顯著低于假手術(shù)組。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示血管平滑肌細(xì)胞線粒體熒光由假手術(shù)組的156.6±11.8降低到休克組的48.8±7.1（P=0.000），提示重

10、癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，可能伴隨線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷。
　　 綜上所述，重癥休克通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體-線粒體軸引起血管平滑肌細(xì)胞線粒體損傷。我們查明此時(shí)血管平滑肌細(xì)胞缺氧，不僅與微循環(huán)障礙有關(guān)，還可能存在細(xì)胞病性缺氧，本質(zhì)是線粒體損傷，因此保護(hù)線粒體可能是重癥休克治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　 二、查明新的線粒體保護(hù)劑-虎杖苷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)
　　 在3種保護(hù)劑中，環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇

11、和虎杖苷不同程度地抑制重癥休克引起的線粒體腫脹等結(jié)構(gòu)破壞，其中虎杖苷的保護(hù)效果最顯著，線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常;在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，線粒體去極化的血管平滑肌細(xì)胞由休克組的80.34±9.01％分別降低到為75.38±18.33％、53.69±17.10％和31.57±6.12％，同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞ATP含量由休克組正常水平的17.61±7.89％分別增加到32.69±5.45％、62.12±11.49％和90.71±7.

12、47％;在3種線粒體保護(hù)劑治療后重癥休克激活的KATP得到部分抑制，其中虎杖苷效果最顯著，在電壓鉗制在+80 mV時(shí)，休克虎杖苷治療組電流密度由休克組的15.7±7.3 pA/pF減少至9.4±4.2pA/pF。和KATP的變化一樣，休克虎杖苷治療組的細(xì)胞跨膜電位由休克組的-49.7±5.3 mV降低到的-36.9±7.2 mV;在3種保護(hù)劑治療后血管平滑肌細(xì)胞LPO含量均有下降，其中在休克虎杖苷治療組下降程度最顯著，由休克組的15.0

13、0±2.23 nmol降低到10.42±0.99 nmol（P=0.000）;3種線粒體保護(hù)劑抑制了重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞溶酶體紅色吖叮橙熒光和線粒體綠色鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度減弱，其中虎杖苷作用效果最顯著，在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，“蒼白細(xì)胞”由休克組的51.63±4.77％，分別減少到42.05±2.81％、47.46±3.06％和36.85±3.84％，同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體綠色鈣黃綠素?zé)晒庥尚菘私M48.8±7.1恢復(fù)到

14、環(huán)孢霉素A治療組的59.7±13.4，白藜蘆醇治療組的62.3±24.8和虎杖苷治療組的79.6±8.6。總之，3種線粒體保護(hù)劑通過(guò)抑制重癥休克時(shí)氧化應(yīng)激和隨后的溶酶體膜通透及線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放發(fā)揮了保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞線粒體的作用，其中虎杖苷作用效果最強(qiáng)，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的ATP含量增加到正常水平的90.71±7.47％。因此虎杖苷是重癥休克治療中理想的線粒體保護(hù)劑。
　　 第二部分大鼠多臟器實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體在重癥休克中發(fā)生的變

15、化
　　 重癥休克時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元和肝細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷。1.重癥休克時(shí)線粒體有類(lèi)似的形態(tài)學(xué)改變，即線粒體腫脹，嵴排列紊亂，斷裂呈空泡，基質(zhì)低電子密度，提示重癥休克誘導(dǎo)多臟器線粒體結(jié)構(gòu)破壞。2.細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低，以血管平滑肌細(xì)胞最為顯著，ATP含量降低到正常水平的17.61±7.87％，提示重癥休克時(shí)多臟器線粒體功能不全。3.線粒體跨跨膜電位降低，提示重癥休克時(shí)多臟器線粒體電子傳遞鏈功能不全和線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放。

16、4.有類(lèi)似的發(fā)病過(guò)程，即LPO含量和“蒼白”細(xì)胞增加，線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，提示氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體損傷和隨后的線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放參與了重癥休克時(shí)多臟器線粒體損傷。
　　 第三部分線粒體保護(hù)劑對(duì)重癥休克線粒體的保護(hù)作用
　　 一、線粒體保護(hù)劑抑制了重癥休克線粒體結(jié)構(gòu)損傷:在線粒體保護(hù)劑治療后，3種細(xì)胞（血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元和肝細(xì)胞）線粒體腫脹減輕，嵴斷裂減少，基質(zhì)電子密度增加，提示線粒體保護(hù)劑抑制重癥休克誘導(dǎo)的線粒體

17、結(jié)構(gòu)損傷，在虎杖苷治療組最為顯著，線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。
　　 二、線粒體保護(hù)劑抑制重癥休克線粒體跨膜電位降低:在3種線粒體保護(hù)劑治療后，線粒體去極化的細(xì)胞在血管平滑肌細(xì)胞由休克組的80.34±9.01％，分別降低到75.38±18.33％、53.69±17.10％和31.57±6.12％，在神經(jīng)元由休克組的65.86±10.88％，分別降至59.46±8.23％、56.32±13.70％和26.22±7.73％，在肝細(xì)胞分別

18、由休克組的37.21±4.98％分別降至23.09±4.06％、25.12±3.31％和12.49±3.06％，提示線粒體保護(hù)劑可能抑制了重癥休克誘導(dǎo)的線粒體電子傳遞鏈損傷和通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，其中虎杖苷作用效果明顯優(yōu)于環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇。
　　 三、線粒體保護(hù)劑改善了重癥休克線粒體ATP合成功能:在3種線粒體保護(hù)劑治療后，細(xì)胞內(nèi)ATP含量在血管平滑肌細(xì)胞由休克組正常水平的17.61±7.89％分別增加到32.69±5.45％、6

19、2.12±11.49％和90.71±7.47％，在神經(jīng)元由正常水平的44.14±13.81％升高到正常水平（假手術(shù)組）的54.93±13.79％、63.74±16.06％和89.57±9.21％，在肝細(xì)胞由休克組正常水平的48.84±3.84％分別增加地正常水平（假手術(shù)組）的63.03±6.81％，57.56±7.08％，87.17±17.29％，提示線粒體保護(hù)劑顯著改善了重癥休克時(shí)3種細(xì)胞線粒體功能，尤其是虎杖苷，在3種線粒體保護(hù)劑治

20、療組中虎杖苷治療組具有最佳的ATP含量。
　　 四、線粒體保護(hù)劑降低了重癥休克LPO含量:3種線粒體保護(hù)劑治療后，細(xì)胞內(nèi)的LPO含量過(guò)氧化脂質(zhì)含量出現(xiàn)不同程度的下降，其中休克虎杖苷治療組下降最顯著，在血管平滑肌細(xì)胞由休克組正常水平的149.85±22.27％下降到假手術(shù)組的104.00±9.89％，在神經(jīng)元由休克組正常水平的139.93±17.67％降低到正常水平的102.25±9.43％，在肝細(xì)胞由正常水平的211.87±21

21、.05％降低到正常水平（假手術(shù)組）的102.78±19.61％，提示虎杖苷顯著抑制了重癥休克誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和隨后的溶酶體和線粒體損傷。
　　 五、線粒體保護(hù)劑改善了重癥休克溶酶體穩(wěn)態(tài):在環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷治療后，“蒼白細(xì)胞”減少，其中虎杖苷治療組減少最顯著，在血管平滑肌細(xì)胞由休克組的51.63±4.77％減少到36.85±3.84％，在神經(jīng)元由休克組的18.89±2.03％減少到10.12±1.00％，在肝細(xì)胞由休克組

22、的30.14±5.73％減少到5.79±1.28％，提示虎杖苷可以顯著降低重癥休克誘導(dǎo)的溶酶體膜通透。
　　 六、線粒體保護(hù)劑抑制了重癥休克線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放:在線粒體保護(hù)劑（環(huán)孢霉素A、白藜蘆醇和虎杖苷）治療后，線粒體鈣黃綠素?zé)晒獬霈F(xiàn)不同程度的恢復(fù)，其中虎杖苷的作用效果最明顯，在血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞由休克組正常水平的31.16±0.05％增加到50.83±5.49％，在神經(jīng)元由休克組正常水平的60.37±10.06％增加到正常

23、水平的91.32±18.57％，在肝細(xì)胞由休克組正常水平的23.68±2.41％恢復(fù)到46.69±2.89％，提示虎杖苷有效地抑制了重癥休克誘導(dǎo)的線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放。
　　 七、線粒體保護(hù)劑改善了重癥休克的血管反應(yīng)性、血壓:休克大鼠在經(jīng)輸血給藥治療2小時(shí)后，休克組去甲腎上腺素閾值增加到失血前的29.3倍，平均動(dòng)脈壓降至47.23±11.28 mmHg;在環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇治療組，去甲腎上腺素閾值分別降至失血前的10.4倍和1

24、1.8倍，同時(shí)平均動(dòng)脈壓升至55.23±9.92 mmHg和57.10±15.74 mmHg;但是在虎杖苷治療組去甲腎上腺素閾值為失血前的4.8倍，平均動(dòng)脈壓為89.38±16.31 mmHg，提示線粒體保護(hù)劑不同程度地糾正了重癥休克血管低反應(yīng)性和頑固性低血壓，其中虎杖苷的作用效果最顯著。
　　 八、線粒體保護(hù)劑降低重癥休克大鼠大腦皮層NADH水平:在輸血再灌2小時(shí)末，休克組大鼠大腦皮層NADH水平相當(dāng)失血前增加了38.58±6

25、.52％，提示重癥休克大鼠大腦皮層線粒體電子傳遞鏈功能障礙。在3種線粒體保護(hù)劑中，只有虎杖苷治療組大腦皮層NADH水平明顯降低，降低到15.03±3.06％，提示虎杖苷改善了重癥休克大鼠大腦皮層線粒體電子傳遞鏈功能。
　　 九、線粒體保護(hù)劑延長(zhǎng)了重癥休克大鼠的存活時(shí)間:休克組大鼠存活時(shí)間僅僅為5.4±2.6h，24小時(shí)存活率為0;環(huán)孢霉素A和白藜蘆醇治療后，存活時(shí)間分別延長(zhǎng)了2.05倍和1.95倍，但24小時(shí)存活率仍然為0;在虎

26、杖苷治療組大鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)至休克組的4.35倍，24小時(shí)存活率顯著提高到5/8，提示虎杖苷顯著延長(zhǎng)休克大鼠存活時(shí)間。
　　 綜上所述，線粒體保護(hù)劑通過(guò)抑制重癥休克時(shí)氧化應(yīng)激和隨后發(fā)生的溶酶體膜通透及線粒體通透轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放發(fā)揮了保護(hù)多臟器線粒體的作用，糾正重癥休克頑固性低血壓和血管低反應(yīng)性，延長(zhǎng)重癥休克大鼠的存活時(shí)間，提示采用線粒體保護(hù)劑保護(hù)多臟器線粒體成為重癥休克治療的新療法，其中虎杖苷作用效果最顯著，休克虎杖苷治療組大鼠的存活時(shí)

27、間由休克組的5.4±2.6 h延長(zhǎng)到23.7±3.7 h，24小時(shí)存活率延長(zhǎng)到5/8。因此，使用虎杖苷保護(hù)線粒體是重癥休克治療的理想選擇，為臨床重癥休克治療提供了新思路。
　　 結(jié)論：
　　 1.重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體參與了重癥休克頑固性低血壓和低血管反應(yīng)性的發(fā)生，最終導(dǎo)致重癥休克高死亡率和難治性。
　　 2.查明重癥休克時(shí)血管平滑肌細(xì)胞線粒體損傷與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的溶酶體-線粒體軸有關(guān)。
　　 3.