2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、顱腦創(chuàng)傷是戰(zhàn)時(shí)和平時(shí)常發(fā)生的嚴(yán)重傷類,救治尤其困難,傷亡和傷殘率為嚴(yán)重創(chuàng)傷之首。據(jù)報(bào)道,全世界每年至少有1千萬(wàn)顱腦創(chuàng)傷病人。在美國(guó),每年有1.4百萬(wàn)顱腦創(chuàng)傷病人,死亡達(dá)5萬(wàn)人。我國(guó)每年有百萬(wàn)以上的嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷病人,其中死亡約10萬(wàn)人,而存活傷員多并發(fā)傷殘。可見,顱腦創(chuàng)傷已成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。如何降低死亡率、減少傷殘率是創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一直攻克的難題,取得了一些進(jìn)展,特別是通過(guò)多種手段綜合救治,在一定程度上減輕或控制全身性損害的發(fā)生發(fā)

2、展,降低了死亡率。但對(duì)促進(jìn)腦組織再生修復(fù)、神經(jīng)功能恢復(fù)尚未取得突破性進(jìn)展,主要原因是神經(jīng)細(xì)胞再生極為困難。 以往認(rèn)為神經(jīng)元細(xì)胞是終末分化的功能細(xì)胞,失去增殖能力。腦組織或脊髓組織損傷后的修復(fù),主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖修復(fù),缺乏相應(yīng)神經(jīng)元再生,這種不完全性再生導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失,形成智殘或肢殘的嚴(yán)重后果。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入,從腦組織中分離出神經(jīng)干細(xì)胞,體外培養(yǎng)有增殖活性,并可向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化,說(shuō)明神經(jīng)組織中存在少量具增殖活性

3、的干細(xì)胞,可以通過(guò)體內(nèi)途徑增強(qiáng)其增殖并誘導(dǎo)向神經(jīng)元細(xì)胞分化,可能有利于損傷組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能康復(fù)。也可以利用神經(jīng)干細(xì)胞具有體外增殖能力的特性,在體外將少量神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增并定向誘導(dǎo)后移植到損傷部位,或靜脈移植隨血液循環(huán)到達(dá)損傷部位促進(jìn)其修復(fù)。但在臨床應(yīng)用中則難以實(shí)施,因?yàn)椴豢赡軓淖泽w取材分離神經(jīng)干細(xì)胞,獲得異體神經(jīng)干細(xì)胞亦十分困難,胚胎干細(xì)胞涉及倫理學(xué)問(wèn)題,加之異體細(xì)胞移植的免疫排斥問(wèn)題、體外擴(kuò)增后的細(xì)胞成瘤風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題遠(yuǎn)未解決。

4、 然而,成體干細(xì)胞具多向分化潛能的理論認(rèn)識(shí),為再生醫(yī)學(xué)、創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域開創(chuàng)了新局面,拓展了新思路,奠定了新途徑。不少文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有可獲得性(自體或異體來(lái)源)、體外大量擴(kuò)增性和體外誘導(dǎo)的多向分化性(成骨分化、成肌分化、成脂分化、成神經(jīng)細(xì)胞分化等),本單位前期研究還證實(shí),將綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞靜脈移植給受10Gyγ線全身照射的同種小鼠(多臟器損傷模

5、型),移植的GFP陽(yáng)性骨髓細(xì)胞廣泛存在于受體小腸、肝、腦、皮膚等多種組織臟器,通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫組化分析,有的移植細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為小腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞,又將原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入MSCs培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)MSCs可轉(zhuǎn)化表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞的分子標(biāo)志。綜合體內(nèi)體外結(jié)果分析認(rèn)為,MSCs通過(guò)血液循環(huán)定植于損傷局部,并受局部壁龕微環(huán)境因素和體液因素調(diào)節(jié)分化為局部功能細(xì)胞。而生理情況下,MSCs大量存在骨髓,循環(huán)血液中僅有少量,如果采取措

6、施動(dòng)員骨髓中的MSCsl進(jìn)入血液循環(huán),使定植于損傷局部的MSCs數(shù)量增加,并在微環(huán)境因素調(diào)節(jié)下分化為功能細(xì)胞,必將有利于創(chuàng)傷(包括顱腦創(chuàng)傷)組織修復(fù)和功能恢復(fù)。利用干細(xì)胞的生物學(xué)特性,切入創(chuàng)傷救治研究,探索促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)的實(shí)用新途徑并闡明相關(guān)機(jī)理,對(duì)揭示干細(xì)胞分化受微環(huán)境調(diào)控機(jī)制和推進(jìn)臨床創(chuàng)傷救治具有重要意義。 因此,本課題第一部分建立從大鼠、人等不同種屬外周血分離培養(yǎng)MSCs的方法,以成纖維細(xì)胞集落形成單位(colonyfo

7、rmingunits-fibroblast,CFU-F)技術(shù)定量分析動(dòng)物體內(nèi)注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)后,是否增加外周血MSCs數(shù)量,以明確G-CSF的動(dòng)員效應(yīng),進(jìn)一步分析經(jīng)動(dòng)員進(jìn)入外周血的MSCs是否保留骨髓MSCs的分子標(biāo)志和多向分化潛能,尤其是闡明能否向神經(jīng)元細(xì)胞分化,有無(wú)神經(jīng)元細(xì)胞的電生理活動(dòng)。第二部分自行改進(jìn)制作顱腦撞擊傷致傷裝具,復(fù)制嚴(yán)重顱腦創(chuàng)

8、傷小鼠模型(50gx30cm撞擊力),設(shè)計(jì)3種G-CSF劑量分別注射給3組致傷小鼠,觀測(cè)動(dòng)物14天內(nèi)的累積死亡率,參照Bederson等評(píng)分方法和Shapira等評(píng)分方法對(duì)致傷小鼠分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的動(dòng)態(tài)觀測(cè),從整體水平評(píng)估G-CSF動(dòng)員骨髓細(xì)胞參與嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷的救治作用。由于G-CSF不僅可以動(dòng)員骨髓MSCs進(jìn)入血液循環(huán),也可動(dòng)員造血干祖細(xì)胞或其它細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán),參與顱腦創(chuàng)傷修復(fù)主要是哪類細(xì)胞?創(chuàng)傷局部主要是什么因

9、素吸引循環(huán)細(xì)胞定植?定植后的細(xì)胞在原位能否轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞?這些問(wèn)題還鮮未闡明。故設(shè)計(jì)第三部分實(shí)驗(yàn),Westernblot方法檢測(cè)對(duì)MSCs具趨化作用的基質(zhì)源性細(xì)胞因子-1(stromal-derivedfactor-1,SDF-1)表達(dá)量的變化,采用經(jīng)典方法將GFP轉(zhuǎn)基因骨髓細(xì)胞分為MSCs細(xì)胞、造血干祖細(xì)胞和其它細(xì)胞3類,分別移植給顱腦創(chuàng)傷小鼠,以確定參與顱腦創(chuàng)傷修復(fù)的細(xì)胞類型,用雙標(biāo)(GFP和NeuN等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志分子)免疫組化鑒定

10、移植細(xì)胞的轉(zhuǎn)化類型,獲如下主要結(jié)果與結(jié)論。 1.對(duì)不同種屬進(jìn)行外周血MSCs分離培養(yǎng),成功率不同,其直接原因是生理?xiàng)l件下外周血中存在的MSCs量少導(dǎo)致的。在本實(shí)驗(yàn)條件下,我們可以穩(wěn)定的直接分離培養(yǎng)出大鼠外周血的MSCs。 2.通過(guò)CFU-F分析,證實(shí)G-CSF可以有效對(duì)動(dòng)員大鼠骨髓和外周血MSCs(接近4倍),動(dòng)員的外周血MSCs特性鑒定實(shí)驗(yàn)顯示:其形態(tài)上和骨髓MSCs一致;并陽(yáng)性表達(dá)MSCs的標(biāo)志分子:CD44、CD7

11、3、CD90和CD106,不表達(dá)造血系的標(biāo)志分子:CD31和CD45;并具有成骨、成脂和成神經(jīng)元的分化能力。證實(shí)其為真正的MSCs。 3.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),動(dòng)員的MSCs可以在β-巰基乙醇、神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液和組合誘導(dǎo)劑(含生長(zhǎng)因子和化學(xué)分子的雞尾酒似的混合誘導(dǎo)劑)誘導(dǎo)下向神經(jīng)元分化,表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志分子:NF、NSE和NeuN。在神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液的誘導(dǎo)下,動(dòng)員的MSCs還可出現(xiàn)功能上的改變:類似神經(jīng)元的內(nèi)向鈉電流。 4

12、.確定撞擊小鼠頭部的撞擊力為50gx30cm,建立穩(wěn)定的小鼠嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷模型,為下一步的實(shí)驗(yàn)提供研究平臺(tái)。 5.通過(guò)在不同時(shí)相點(diǎn)觀察創(chuàng)傷小鼠的神經(jīng)行為學(xué)和運(yùn)動(dòng)功能的改變、累積死亡率及病理切片,發(fā)現(xiàn)注射G-CSF后,嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷小鼠在神經(jīng)行為學(xué)和運(yùn)動(dòng)功能上有顯著改善,累計(jì)死亡率顯著降低,從整體水平上證實(shí)G-CSF對(duì)嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷小鼠具有救治效應(yīng)。并證實(shí)在本實(shí)驗(yàn)條件下,G-CSF的最佳動(dòng)員劑量為20μg/kg.d。 6.將GF

13、P轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞通過(guò)貼壁培養(yǎng)和磁珠分選分成3種細(xì)胞:MSCs、造血干細(xì)胞、其它類細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)分選效果比較好。將分選的細(xì)胞移植到嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷小鼠,結(jié)果表明:在大腦組織中未發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的造血干細(xì)胞和其它類細(xì)胞的定植。GFP標(biāo)記的MSCs移植顱腦創(chuàng)傷小鼠后5d、10d、15d和20d,均在大腦發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。證實(shí)骨髓細(xì)胞中是MSCs參與了小鼠嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷的修復(fù)。 7.Westernblot檢測(cè)

14、撞擊傷小鼠創(chuàng)位不同時(shí)相點(diǎn)的SDF-1的表達(dá),結(jié)果顯示,小鼠嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷后,創(chuàng)位腦組織的SDF-1高表達(dá),顯著高于正常腦組織的SDF-1。在撞擊傷后7d,SDF-1的表達(dá)達(dá)到高峰。Westernblot檢測(cè)撞擊傷小鼠傷后第7d不同組織SDF-1的表達(dá),結(jié)果顯示,小鼠嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷第7d后,創(chuàng)位腦組織的SDF-1高表達(dá),顯著高于其他組織的SDF-1。其他組織中心臟的SDF-1表達(dá)最低。證實(shí)小鼠腦部創(chuàng)傷后可高表達(dá)SDF-1分子,吸引、趨化動(dòng)員的

15、MSCs向腦損傷部位移行、定植。 8.NeuN為神經(jīng)元的特異標(biāo)志分子,在核上表達(dá)。因此,用NeuN為一抗進(jìn)行熒光免疫組化,可觀察到腦組織神經(jīng)元的分布情況。以熒光雙標(biāo)免疫組化實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察GFP標(biāo)記的MSCs在腦創(chuàng)位向神經(jīng)元(表達(dá)特異標(biāo)志分子NeuN)的分化。結(jié)果顯示,第10d和20d的標(biāo)本都可見同時(shí)表達(dá)NeuN分子和GFP分子的移植細(xì)胞,證實(shí)移植的GFP標(biāo)記MSCs在腦創(chuàng)位向神經(jīng)元分化,從而參與嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷的修復(fù)。 9.以熒

16、光雙標(biāo)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察MSCs在嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷小鼠的創(chuàng)位向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,第7d、12d和20d的標(biāo)本都可見同時(shí)表達(dá)GFAP分子和GFP分子的移植細(xì)胞,表明移植的MSCs(GFP標(biāo)記)還可通過(guò)在腦創(chuàng)位向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化而促進(jìn)嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷的修復(fù)。 10.基于上述研究結(jié)果,我們提出,對(duì)嚴(yán)重顱腦創(chuàng)傷傷員,采用G-CSF可有效動(dòng)員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán),循環(huán)中的間充質(zhì)干細(xì)胞受損傷部位高表達(dá)SDF-1的吸

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