癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元程序性死亡與μ-calpain相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、本研究通過建立氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(lithium chloride-pilocarpine-induced status epilepticus，LPSE)模型，檢測SE后海馬神經(jīng)元損傷的病理特征，PCD狀況，μ-calpain和部分相關(guān)凋亡分子的活性。應(yīng)用μ-calpain抑制劑MDL-28170進行干預(yù)，檢測μ-calpain介導(dǎo)的PCD相關(guān)蛋白、基因表達變化和信號通路以及其對SE后海馬神經(jīng)元的保護作用。本研究共

2、分三部分進行。 第一部分氯化鋰-匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬損傷和神經(jīng)元程序性死亡 目的：研究LPSE模型大鼠行為學、電生理及病理學改變，進一步探討癲癇發(fā)作造成的海馬神經(jīng)元損傷，觀察癲癇后神經(jīng)元PCD的存在。 方法： 1.成年雄性Wistar大鼠，分為對照組、致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d組，腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)大鼠出現(xiàn)SE，SE持續(xù)2 h后注射地西泮終止發(fā)作。 2

3、.于致癇前、后對大鼠進行EEG描記。 3.將大鼠在各時間點多聚甲醛灌注取腦，用HE(1aaematoxylin&eosin)和Nissl染色觀察大鼠海馬病理學改變。 4.應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(terminal deoxy-nucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick-end-labeling，TUNEL)觀察海馬神經(jīng)元程序性死亡改變。

4、 結(jié)果： 1.氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠SE誘發(fā)率為91.7％；EEG在急性期表現(xiàn)為叢集性棘波放電，潛伏期EEG正常。 2.HE及Nissl染色示正常大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。于SE后6 h-7 d均可觀察到大鼠海馬神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元腫脹、破裂，排列紊亂，胞漿尼氏小體減少，存活神經(jīng)元數(shù)目較對照組減少(P＜0.05)。 3.SE后6 h大鼠海馬就可見少量TU

5、NEL標記細胞，3 d時TUNEL陽性神經(jīng)元顯著增多，持續(xù)到7 d。各組TUNEL標記細胞數(shù)均比對照組明顯增多(P＜0.05)，3 d、5 d及7 d大鼠與6 h、12 h及1 d組亦有顯著差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.依致癇后大鼠行為學及EEG改變氯化鋰-匹羅卡品成功誘發(fā)大鼠SE模型。 2.LPSE可造成大鼠海馬神經(jīng)元損傷。 3.LPSE可致大鼠海馬神經(jīng)元程序性死亡。 第二部分μ-calp

6、ain介入氯化鋰-匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元程序性死亡的研究 目的：研究μ-calpain參與LPSE大鼠海馬神經(jīng)元PCD的過程及其抑制劑的保護作用。 方法： 1.成年雄性Wistar大鼠，分正常對照及致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d組，腹腔注射氯化鋰.匹羅卡品誘發(fā)大鼠出現(xiàn)SE，SE持續(xù)2 h后注射地西泮終止發(fā)作。研究μ-calpain抑制劑MDL-28170時選擇致癇后3 d大鼠分

7、為匹魯卡品組，匹魯卡品+生理鹽水組，匹魯卡品+MDL-28170組以及正常對照組。 2.大鼠分別在各時間點多聚甲醛灌注取腦，應(yīng)用免疫組織化學(immunohisto-chemistry,IHC)方法觀察μ-calpain及caspase-3的活性表達變化及MDL-28170對其表達的影響。 3.于各時間點大鼠斷頭取腦，快速冰上取海馬，提取海馬組織蛋白，應(yīng)用免疫印跡(Western blotting)方法檢測海馬μ-cal

8、pain、caspase-3和α-II-血影蛋白(α-II-spectrin，αIISp)的表達以及MDL-28170對其表達的影響。 4.應(yīng)用Nissl染色觀察MDL-28170對SE后大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響。 5.應(yīng)用TUNEL方法研究MDL-28170對海馬神經(jīng)元程序性死亡的影響。 結(jié)果： 1.μ-calpain在LPSE后6 h后即激活，3 d達高峰，而caspase-3在致癇后1 d開始激活，

9、5-7 d達高峰。μ-calpain特異性145kD-αIISp片段及caspse-3特異性120kD-αIISp片段的表達與μ-calpain和caspase-3活性表達相似。 2.μ-calpain抑制劑MDL-28170能減少LPSE后海馬神經(jīng)元的損傷，MDL組存活神經(jīng)元的數(shù)目較匹魯卡品組，匹魯卡品+生理鹽水組明顯增多(P＜0.05)。 3.μ-calpain抑制劑MDL-28170能減少LPSE后海馬神經(jīng)元PCD

10、的程度，較匹魯卡品組，匹魯卡品+生理鹽水組凋亡細胞數(shù)目減少(P＜0.05)。 4.μ-calpain抑制劑MDL-28170能減弱LPSE后μ-calpain及其特異性145kD-αIISp片段的表達，但對caspse-3及其特異性120kD-αIISp片段的表達沒有影響。 結(jié)論： 1.μ-calpain及caspase-3均參與LPSE大鼠海馬神經(jīng)元PCD損傷過程，μ-calpain介入PCD的早期過程，而ca

11、spase-3則介入晚期過程。 2.μ-calpain抑制劑MDL-28170通過抑制μ-calpain的表達對LPSE大鼠海馬神經(jīng)元起保護作用，并能減輕PCD的程度。 第三部分μ-calpain介入氯化鋰-匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元程序性死亡信號通路的研究 目的：研究μ-calpain介入LPSE大鼠海馬神經(jīng)元PCD的細胞信號通路。 方法： 1.成年雄性Wistar大鼠，腹腔注射氯化鋰-

12、匹羅卡品誘發(fā)大鼠出現(xiàn)SE，持續(xù)2 h后注射地西泮終止發(fā)作。 選取對照組、致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d和7 d組應(yīng)用Western blotting方法分析相關(guān)蛋白的表達及動態(tài)變化； 選取致癇后3 d大鼠分為對照組，匹魯卡品組，匹魯卡品+生理鹽水組、匹魯卡品+MDL-28170組、匹羅卡品+ZVF組觀測各抑制劑對相關(guān)蛋白和基因的表達影響。MDL-28170為μ-calpain選擇性抑制劑(致癇前后腹腔注射

13、)，ZVF即Z-VAD(OMe)-fmk為caspases廣譜抑制劑(致癇前后腦室注射)。 2.將各組大鼠斷頭取腦，海馬-80℃存儲待用。 3.應(yīng)用Western blotting方法檢測對照組及LPSE后大鼠Bid蛋白的表達，AIF及細胞色素C蛋白不同亞細胞組分的表達變化。 4.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)方

14、法檢測對照組及LPSE后3 d大鼠海馬μ-calpain、caspase-3、caspase-8和caspase-9、Bid及AIF mRNA水平表達及MDL-28170和ZVF對其表達的影響。 5.應(yīng)用Western blotting方法檢測對照組及LPSE后3 d大鼠海馬Bid、AIF、和細胞色素C蛋白的表達，以及MDL-28170及ZVF對其表達的影響。 結(jié)果： 1.大鼠海馬在LPSE后12 h、1 d、3

15、 d、5 d及7 d蛋白tBid的表達、AIF的核轉(zhuǎn)位及細胞色素C的釋放較對照組有顯著差異(P＜0.05)，但tBid表達、AIF的核轉(zhuǎn)位及細胞色素C從線粒體釋放在SE后3 d最明顯，此后逐漸減弱，但仍較對照組明顯(P＜0.05)。 2.LPSE后3 d大鼠海馬神經(jīng)元μ-calpain、Bid、AIF mRNA水平上調(diào)(P＜0.05)，但caspase-3、caspase-8及caspase-9 mRNA水平輕度上調(diào)，與對照組比

16、較仍有差異(P＜0.05)。MDL-28170能抑制μ-calpain、Bid及AIF mRNA表達水平(P＜0.05)，而對caspase-3、caspase-8及caspase-9未有影響(P＞0.05)。ZVF則對μ-calpainmRNA水平表達未有明顯影響(P＞0.05)，可減弱caspase-3、caspase-8及caspase-9的mRNA表達(P＜0.05)(圖2 A，B)，能輕度減弱Bid及AIF的表達，但與匹羅卡品