托吡酯對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及caspase-3、bcl-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：托吡酯(topiramate,TPM)，2，3：4，5-雙-O(1-甲基亞乙基)-β-D-氨基磺酸呋喃果糖，是一種從D-果糖衍生的單糖，是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新型抗癲癇藥，為白色結(jié)晶粉末，其抗癲癇作用在動物實驗和臨床上得到證實。本研究用托吡酯預(yù)處理，采用海人酸(kanicacid,KA)腹膜腔注射的方法制作大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE)模型，觀察了TPM對大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及caspase-3、

2、bcl-2表達(dá)的影響，以探討托吡酯可能的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 1.實驗動物及分組：選用健康成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為海人酸生理鹽水組(KA組)和海人酸托吡酯組(TPM組)。每組再分為四個小組，分別用于SE后3、12、24和48h時點(diǎn)，每小組12只；另取12只大鼠作為正常對照(NS組)。 2.TPM干預(yù)及SE模型的制作：予TPM給TPM組大鼠灌胃(18mg/kg/d)15天，同時給KA組及NS組大鼠灌等量的

3、生理鹽水。然后采用海人酸(10mg/kg)給KA組和TPM組大鼠腹膜腔內(nèi)注射，同時給對照組大鼠腹膜腔注射相同容量的生理鹽水。觀察大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作的時間和表現(xiàn)，并使之持續(xù)2h，然后腹膜腔注射地西泮(10mg/kg)以終止癇性發(fā)作。 3.取材：分別于SE終止后相應(yīng)時點(diǎn)，采用4﹪多聚甲醛經(jīng)左心灌注固定后，取大鼠雙側(cè)海馬的CA3區(qū)。左側(cè)置入3﹪戊二醛中保存，用于電鏡觀察，右側(cè)置入10﹪多聚甲醛后固定，用于免疫組化染色。 4.電鏡

4、標(biāo)本的制作：常規(guī)固定，切取厚約1μm的半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，在光鏡下觀察、定位；再切取厚約75nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，電鏡觀察并拍照。 5.石蠟切片制作：常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后，選取CA3區(qū)連續(xù)切片備用。常規(guī)HE染色，并按常規(guī)SP法進(jìn)行bcl-2和caspase-3免疫組織化學(xué)染色。 6.DNA提取和電泳：從相同的腦區(qū)提取DNA，提取的DNA在含有溴乙錠的瓊脂凝膠上電泳，來檢測有無核內(nèi)DNA

5、的裂解(核內(nèi)DNA裂解后會出現(xiàn)特征性的梯狀DNA電泳帶)。注射了生理鹽水的成年雄性鼠被用作正常對照。 7.統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行t檢驗和方差分析。 結(jié)果 1.行為學(xué)表現(xiàn)：KA組大鼠出現(xiàn)SE的時間為注入海人酸后85.2±5.6min，動物平均達(dá)到Ⅳ級發(fā)作；TPM組大鼠出現(xiàn)SE的時間為注入海人酸后107.4±6.4min，動物平均達(dá)到Ⅲ級發(fā)作。NS組未出現(xiàn)

6、SE。 2.電鏡觀察結(jié)果：NS組大鼠神經(jīng)元呈正常結(jié)構(gòu)；KA組大鼠神經(jīng)元主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)濃縮、電子密度增高、細(xì)胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，呈凋亡特征，亦有少量壞死的神經(jīng)元；TPM組神經(jīng)元呈大致正常結(jié)構(gòu)，但觀察到核仁靠邊、高爾基體豐富及溶酶體增多的現(xiàn)象。亦觀察到少量正在凋亡的神經(jīng)元。 3.HE染色結(jié)果：NS組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列整齊緊密，邊緣清晰，胞漿透明，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，形態(tài)正常；KA組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)散

7、亂，邊緣欠清晰，胞質(zhì)嗜伊紅，核固縮濃染。TPM組大鼠可見CA3區(qū)有散在的神經(jīng)元噬酸性改變。 4.caspase-3免疫組化染色：空白對照組可見海馬內(nèi)有少量散在的caspase-3陽性細(xì)胞，著色不深；KA組3h時點(diǎn)海馬區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比，無明顯變化(P＞0.05)，12h點(diǎn)有較多細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)有棕黃色沉淀物，24h點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)及著色深度達(dá)到高峰；TPM組3h點(diǎn)海馬內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)與對照組相比，無明顯變化(P＞0.05)，12

8、h點(diǎn)可見較多陽性細(xì)胞數(shù)，染色較深；24h點(diǎn)相對達(dá)到高峰。其中TPM組表達(dá)較KA組輕微，12～48h點(diǎn)均有顯著性差異。 5.bcl-2免疫組化染色：空白對照組可見有bcl-2的微量表達(dá)，主要為胞漿和核膜淡黃色，均勻彌漫染色；KA組12h點(diǎn)即可見海馬CA3區(qū)有較明顯表達(dá)，24、48h點(diǎn)表達(dá)明顯減弱；TPM組12h點(diǎn)海馬區(qū)有明顯表達(dá)，24和48h點(diǎn)有強(qiáng)表達(dá)，胞漿及核膜著色，呈棕黃色，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒聚集。其中12h點(diǎn)KA組、TPM

9、組兩組有顯著差異(P＜0.05)，24h及48h點(diǎn)差異性顯著(P＜0.001)。 6.DNA電泳結(jié)果：KA組、TPM組大鼠于第24h和第48h兩個時點(diǎn)均出現(xiàn)DNA梯狀電泳帶。生理鹽水對照組大鼠未出現(xiàn)DNA梯狀電泳帶。 結(jié)論 1.癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的明顯改變，神經(jīng)元表現(xiàn)出明顯的凋亡特征(亦有少量壞死的神經(jīng)元)；TPM預(yù)處理后，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)基本正常，但表現(xiàn)出代謝旺盛的征象(細(xì)胞器增多)，亦有少量凋亡的