靶向超聲造影評(píng)價(jià)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、靶向超聲造影評(píng)價(jià)免腹主動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究目的 整合ICAM-1單克隆抗體及自制含氟烷人血白蛋白超聲造影劑，制備攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑，探討超聲造影劑的靶向制備技術(shù)；建立動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)早期血管內(nèi)皮功能損傷的動(dòng)物模型以及腹主動(dòng)脈粥樣硬化的模型，評(píng)價(jià)攜抗ICAM-1的超聲造影劑在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)早期診斷中的靶向價(jià)值和意義，為靶向超聲造影劑的制備及其在外周血管疾病中的臨床應(yīng)用

2、進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。 資料與方法 1.靶向超聲造影劑的制備 將自制含氟烷人血白蛋白超聲造影劑與小鼠ICAM-1單克隆抗體1：1混合，而后按一定比例與濃度加入戊二醛，置于4℃冰箱孵育2h，促使抗體與微泡外殼充分交聯(lián)。微泡與抗體交聯(lián)反應(yīng)后，以PBS洗滌、離心，分層，去除下層未結(jié)合的游離抗體，取上層懸浮液，即得攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑。使用血細(xì)胞記數(shù)儀檢測(cè)靶向造影劑微泡的濃度，普通光鏡下評(píng)估靶向微泡的大小、

3、形態(tài)。另取少量現(xiàn)制的攜抗ICAM-1的白蛋白靶向造影劑及普通含氟烷人血白蛋白造影劑，分別與等量異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG混合，恒溫孵育30min，PBS洗滌、離心、分層后取上浮液，在熒光顯微鏡下觀察兩種造影劑微泡外殼各自的熒光染色情況。以靶向超聲造影劑微泡外殼發(fā)明亮綠色熒光而普通白蛋白造影劑微泡外殼無(wú)熒光顯示為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定ICAM-1單克隆抗體與含氟烷人血白蛋白造影

4、劑整合成功。 2.研究對(duì)象及實(shí)驗(yàn)方法 (1)新西蘭大白兔16只，高脂喂飼4周建立腹主動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的動(dòng)物模型后，實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為兩組，分別經(jīng)兔耳緣靜脈推注普通含氟烷人血白蛋白超聲造影劑(第1組)和攜抗ICAM-1的白蛋白靶向超聲造影劑(第2組)，普通、靶向造影劑的使用劑量均為0.02ml/kg。高脂喂飼前及喂飼4周末，超聲造影觀察普通、靶向兩種白蛋白微泡在正常兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜及ICAM-1過(guò)度表達(dá)的損傷血管內(nèi)膜的顯影情況

5、，并對(duì)兩組的超聲造影結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。高脂喂飼4周末，超聲造影后處死動(dòng)物，取兩組兔腹主動(dòng)脈標(biāo)本，標(biāo)本分做兩份備用。一部分標(biāo)本用2.5％戊二醛固定，透射電鏡評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變；掃描電鏡下觀察白蛋白造影劑在損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附、結(jié)合情況，并比較普通、靶向兩種白蛋白造影劑在損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附程度的差異；另一部分標(biāo)本做成厚度8μm的冷凍組織切片，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人血白蛋白單克隆抗體工作液50μl

6、，恒溫孵育30min，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)普通、靶向兩種白蛋白造影劑在兔腹主動(dòng)脈損傷內(nèi)膜組織中的分布情況，熒光顯微鏡下觀察并比較兩組動(dòng)物腹主動(dòng)脈內(nèi)膜組織熒光染色程度的差異。 (2)新西蘭大白兔26只，高脂喂飼12周建立腹主動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型后，把實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分做三組，第1、2組實(shí)驗(yàn)兔分別使用普通、靶向造影劑行腹主動(dòng)脈超聲造影，第3組實(shí)驗(yàn)兔同時(shí)應(yīng)用兩種造影劑造影。普通、靶向造影劑的使用劑量均為0.02ml/kg。對(duì)三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象

7、的超聲造影結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析，定量評(píng)估各組對(duì)象造影前、后血管內(nèi)膜及粥樣硬化斑塊灰階視頻密度值的改變，比較普通、靶向兩種白蛋白造影劑在改善血管內(nèi)膜、粥樣硬化斑塊灰階顯像中的不同作用。超聲造影后處死第1、2組實(shí)驗(yàn)對(duì)象，取兔腹主動(dòng)脈標(biāo)本，標(biāo)本分三份。一部分標(biāo)本用10％福爾馬林固定、包埋做HE染色常規(guī)病理切片，光鏡下觀察腹主動(dòng)脈粥樣硬化的病理組織學(xué)特征；另一部分標(biāo)本做成石蠟組織切片，在組織切片上依次加入鼠抗人血白蛋白單克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物

8、酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育、洗滌后，光鏡下觀察普通、靶向兩種白蛋白造影劑在腹主動(dòng)脈炎癥血管壁中的免疫組化染色結(jié)果；還有一部分標(biāo)本做成厚度8μm的冷凍組織切片，加入FITC標(biāo)記的抗人血白蛋白單克隆抗體工作液50μl，恒溫孵育30min后，在熒光顯微鏡下觀察并比較兩種白蛋白造影劑在腹主動(dòng)脈炎癥血管壁中的免疫熒光染色結(jié)果。 結(jié)論 1.制備靶向超聲造影劑的關(guān)鍵是將靶向配體連接到微泡壁上。本研究根據(jù)白蛋白微泡的成膜材料特征和單克

9、隆抗體的化學(xué)性質(zhì)，采用戊二醛交聯(lián)法將ICAM-1單克隆抗體整合于白蛋白造影劑微泡外殼，成功制備出攜抗ICAM-1的含氟烷人血白蛋白靶向超聲造影劑，方法簡(jiǎn)便、成本低、重復(fù)性好，具有較好的應(yīng)用前景。 2.由于ICAM-1在正常組織中幾乎不表達(dá)，所以攜抗ICAM-1的造影劑微泡在正常血管內(nèi)膜結(jié)合很少。而在動(dòng)脈粥樣硬化形成區(qū)，攜抗ICAM-1的造影劑微泡可靶向黏附于ICAM-1過(guò)度表達(dá)的損傷血管內(nèi)膜。靶向超聲造影可據(jù)此識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化早