β半乳糖苷酶發(fā)酵制備工藝研究與酶制劑劑型開(kāi)發(fā)

1、β半乳糖苷酶發(fā)酵制備工藝研究半乳糖苷酶發(fā)酵制備工藝研究與酶制劑劑型開(kāi)發(fā)與酶制劑劑型開(kāi)發(fā)FermentationProductionFmulationPreparationofKluyveromyceslactisβGalactosidase學(xué)科專業(yè)：化學(xué)工程研究生：尤生萍指導(dǎo)教師：何志敏教授企業(yè)導(dǎo)師：李小剛高級(jí)工程師天津大學(xué)化工學(xué)院2014年5月萬(wàn)方數(shù)據(jù)1摘要β半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）屬于水解酶，能特異性水解βD半乳糖苷類化合

2、物的βD半乳糖苷鍵，同時(shí)具有轉(zhuǎn)糖苷活力，可以用來(lái)催化生成低聚半乳糖。β半乳糖苷酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和生化分析等領(lǐng)域。本文以乳酸克魯維酵母發(fā)酵產(chǎn)β半乳糖苷酶為研究核心，首先從上游發(fā)酵制備入手，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，在小試階段（7L發(fā)酵罐）進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化和新型流加培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，并開(kāi)展了以乳清粉為碳源和主要能量來(lái)源的工業(yè)培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)，最后進(jìn)行下游β半乳糖苷酶酶制劑的制備研究。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：通過(guò)響應(yīng)面分析法

3、得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方與搖瓶培養(yǎng)條件：乳糖20gL，蛋白胨5gL，酵母膏12gL，麥芽浸膏5gL，Na2HPO4?12H2O0.01molL，MgSO40.6gL，F(xiàn)eSO40.06gL，pH8.48，溫度27.6oC，接種量5%（vv）。在此條件下，β半乳糖苷酶的發(fā)酵酶活達(dá)到20.60UmL，比原始培養(yǎng)條件中酶活(6.85UmL)提高了約兩倍。以上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為基礎(chǔ)進(jìn)行小試階段（7L發(fā)酵罐）的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，其結(jié)果為：當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為200r

4、pm，通氣量為5Lmin時(shí)。在該條件下，β半乳糖苷酶酶活可達(dá)48.41UmL，生物量達(dá)到7.21gL。為了進(jìn)一步提高β半乳糖苷酶產(chǎn)量，研究開(kāi)發(fā)了一套pH值反饋調(diào)控的新型流加培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)21h后，β半乳糖苷酶酶活、生產(chǎn)效率及生物量分別高達(dá)111.61UmL、5.31U(mL?h)和10.73mg干細(xì)胞mL，與間歇培養(yǎng)相比，分別提高了1.31倍，3.18倍和0.49倍。以乳清粉為主要原料開(kāi)發(fā)了一套理想的工業(yè)培養(yǎng)基配方：乳清粉60gL，酵母

5、膏9gL，蛋白胨3gL，MnCl20.03gL，ZnCl20.058gL，pH8.0。從搖瓶階段和小試階段的綜合分析，該工業(yè)配方產(chǎn)酶效率與已優(yōu)化的傳統(tǒng)配方大體一致，但是，前者獲得的特殊酶活遠(yuǎn)高于后者，所以，前者更適合后續(xù)的β半乳糖苷酶酶制劑制備。以上述小試階段發(fā)酵制備所得β半乳糖苷酶細(xì)胞液為原料，經(jīng)優(yōu)化獲得了透性細(xì)胞處理方法。采用自然干燥、冷凍干燥和噴霧干燥三種干燥方法處理透性細(xì)胞懸浮液制備β半乳糖苷酶酶制劑，綜合分析可知，自然干燥法獲