導入β-半乳糖苷酶基因的重組腺病毒的純化.pdf

1、目的：伴隨工業(yè)、農(nóng)業(yè)和交通事業(yè)的發(fā)展，高能量創(chuàng)傷日益增多，周圍神經(jīng)損傷已成為臨床上比較常見的致殘性損傷，而針對周圍神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上比較棘手的問題，盡管顯微外科修復技術(shù)已經(jīng)十分精湛，但長期以來難獲得滿意效果。隨著分子生物及基因工程的發(fā)展，當今針對基因治療研究已成為周圍神經(jīng)損傷研究領(lǐng)域的熱點課題。通過研究發(fā)現(xiàn)在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中把攜帶目的基因的腺病毒作為載體(Adenovirus，AdV)導入后，目的基因就會適時地表達產(chǎn)物，從而

2、達到治療或者研究的目的。
　　其中在介導基因轉(zhuǎn)染方面腺病毒載體具有諸多優(yōu)點，因此在神經(jīng)示蹤研究、神經(jīng)再生和神經(jīng)運動系統(tǒng)疾病的診治中成為應用最廣泛的載體。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)導入以腺病毒作為載體的目的基因，通過目的基因在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達促進周圍神經(jīng)的再生，同時也對神經(jīng)示蹤的研究的具有重要意義。
　　當下，神經(jīng)修復研究領(lǐng)域的熱點是將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因融合到復制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus，AdV)中，再將攜帶目的基因的腺病毒

3、轉(zhuǎn)入到脊髓或周圍神經(jīng)中來對受損的神經(jīng)元進行保護或者在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中誘導周圍神經(jīng)的再生過程。腺病毒載體具有較高的感染效率、廣泛的宿主范圍、可以將分裂期或靜息期細胞感染、巨大的基因裝載量、容易提取高濃度病毒成分、毒性低水平表達等優(yōu)點。利用分子生物技術(shù)克隆乳糖操縱子基因片段LacZ基因構(gòu)建腺病毒載體，制備病毒顆粒從而為進一步研究腺病毒載體介導的LacZ基因在周圍神經(jīng)損傷中的應用。
　　LacZ基因廣泛用于基因表達調(diào)控研究中的一種基因。L

4、acZ基因編碼的beta-半乳糖普酶(簡稱beta-gal)是由4個亞基組成的四聚休，可催化乳糖的水解.Beta-gal比較穩(wěn)定，用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色，便于檢測和觀察.LacZ基因的諸多優(yōu)點使它成為基因工程實驗中的一個常用標記基因，因此它被用于基因的時空表達、探測已知調(diào)控序列有效區(qū)段的位置和作用、尋找未知序列等領(lǐng)域。
　　因此，利用腺病毒安全、穩(wěn)定、高效以及LacZ基因特異性表達等特點當下利用含LacZ基因的腺病毒

5、對周圍神經(jīng)損傷修復進行研究已成為基因治療的前沿。但腺病毒可以被中和抗體迅速地清除，這是由于腺病毒載體的免疫原性比較強，在日常工作生活中腺病毒侵入人體后會誘發(fā)機體產(chǎn)生抗腺病毒中和抗體。如果接受腺病毒載體介導的基因治療后因為中和抗體會消滅腺病毒載體，從而導致腺病毒載體在體內(nèi)的數(shù)量減少而使基因治療失敗。為了達到持續(xù)時間長、表達效果確切等效果，本實驗將已有腺病毒通過轉(zhuǎn)染至293細胞，通過在293細胞中的繁殖，從而提取出具有侵染力的濃縮的高純度病

6、毒。為下一步和今后研究將LacZ基因?qū)階dV后在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達來促進周圍神經(jīng)的再生奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.HEK293細胞的培養(yǎng)把凍存的細胞由-196℃的液氮中快速放入37℃水浴中融化，放入后緩慢搖晃凍存管，使細胞外冰晶融化。3000r/min離心3min融化好的細胞懸液。將上層的上清液吸去，并放入10ml培養(yǎng)液到離心管中，輕輕吹打成懸液，放入細胞培養(yǎng)瓶中。將盛有細胞和培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱

7、的環(huán)境接近人體環(huán)境，為37℃和5％CO2。當細胞生長均勻時，便可計數(shù)一定體積細胞懸液中的細胞數(shù)。然后根據(jù)公式換算出細胞在每毫升細胞懸液中含有的量。細胞生長到占瓶底面積的90％還需要2-3次傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞，挑選形狀飽滿、生長能力強的細胞接種病毒。
　　2.病毒轉(zhuǎn)染把293細胞放入75cm2培養(yǎng)瓶中后加入10mlDMEM5％進行培養(yǎng)。待細胞生長至60％-70％時將培養(yǎng)液倒去，小心加入病毒混合液。十字形輕輕晃動培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液

8、蓋住細胞層。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90分鐘后加入9mlDMEM5％，再經(jīng)過72小時孵育，便可以通過MOI測定來判斷病毒顆粒。
　　3.腺病毒擴增將細胞在-20℃到37℃分別放置半小時，反復三次。用離心管離心后收集上清液冰凍存于-20℃或-80℃。取三瓶培養(yǎng)理想的293細胞，倒掉里面的細胞培養(yǎng)液，將5ml混合液放到每個培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動混勻。放到培養(yǎng)箱中孵育，時間大約為90分鐘。向培養(yǎng)瓶中加入DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，時間大約48-72小時。同

9、樣的方法從第一次被轉(zhuǎn)染的細胞中取上清后再次轉(zhuǎn)染細胞。便可得到再次擴增的病毒。
　　4.病毒的純化離心細胞，待細胞碎片沉淀后取上清液。5 mlPEG8000放入每10ml上清液中，將上清放到冰上1小時使其沉淀。以12000 rpm的速度離心上述混合物，時間大約20 min。將上清液倒去后，在CsCl溶液中加入沉淀物。經(jīng)過5分鐘離心，收集病毒懸浮液。
　　5.50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度取293細胞一瓶，用2％FCS/D

10、MEM將細胞濃度調(diào)整為為7.5×105/ml；將100μl細胞懸液分別放到2塊96孔板中。10孔為一個稀釋度，其中2孔作為陰性對照；經(jīng)過10天培養(yǎng)后鏡下觀察，數(shù)出每一排出現(xiàn)細胞病變現(xiàn)象(CPE)的孔的數(shù)目。并利用Karber方程計算滴度T=101+d(s-0.5)，測出AdLacZ病毒液的TCID50:1010TCID50/ml。
　　結(jié)果：
　　1.正常具有活力的HEK293細胞呈多角形，貼壁較疏松，細胞之間相互連成網(wǎng)狀，

11、并有聚集成團的傾向。
　　2.含lacz基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的293細胞在培養(yǎng)24小時后即可在倒置顯微鏡下觀察到細胞變性即CPE現(xiàn)象而且通過X-g al染色后可觀察到細胞出現(xiàn)藍染，即檢測到報告基因lacz的表達，細胞表達出攜帶目的基因的腺病毒顆粒，對照組未發(fā)現(xiàn)藍染表達。表明轉(zhuǎn)染成功。
　　3.在96孔板上培養(yǎng)293細胞，用獲得病毒感染293細胞后計數(shù)出現(xiàn)CPE孔個數(shù)，測定病毒滴度。最后獲得病毒滴度為1010TCID50/ml(