α-半乳糖苷酶碳源誘導機制研究及復合酶制劑的開發(fā).pdf

1、α-半乳糖苷酶(α-D-galactoside galctohydrolases，EC3.2.1.22)屬于外切糖苷水解酶(exo-glycosidase)的一種，分屬于糖苷水解酶中GH4、GH27、GH36、GH57和GH97等多個家族。該酶廣泛的存在于微生物、植物和動物中，可特異性水解半乳糖殘基的非還原性末端α-1→6半乳糖苷鍵。20世紀70年代起，我國開始對該酶的開發(fā)利用進行研究，該酶被認為是食品工業(yè)、輕工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥業(yè)中最

2、具有應用潛力的酶制劑之一。本文從α-半乳糖苷酶高產菌種選育出發(fā)，探討產α-半乳糖苷酶的碳源誘導機制，優(yōu)化其固體發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成，在此基礎上以廉價的農產品加工副產物為培養(yǎng)基開發(fā)“以α-半乳糖苷酶為標志”的飼用復合酶制劑。論文的主要研究結果如下：
　　 實驗采用X-α-Gal初篩、液體搖瓶復篩并進一步考察固體發(fā)酵能力，從實驗室保存菌株及傳統發(fā)酵豆制品中篩到菌株J-08，具有良好的液體發(fā)酵(3.88 U/mL)及固體發(fā)酵(57.2

3、1 U/g干基)產酶能力，將其編號為zju-Y1。經形態(tài)，BIOLOG生理生化分析及18S rRNA分子鑒定后，確定該菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)。
　　 研究多種農產品加工副產物對黑曲霉zju-Y1產α-半乳糖苷酶的影響，并通過分析各農產品加工副產物組分推測，水蘇糖是黑曲霉zju-Y1產α-半乳糖苷酶最有效的誘導因子之一。迸一步采用單一碳源發(fā)酵驗證，確定在小分子量碳源(單/寡糖)中，水蘇糖具有最顯著的誘導

4、產酶效應，而在大分子碳源中瓜爾豆膠的誘導效應最為顯著。
　　 采用實時熒光定量PCR技術對不同碳源誘導下黑曲霉zju-Y1三個α-半乳糖苷酶表達基因(aglA、aglB、aglC)在轉錄水平上的分析可知，三個基因對碳源的誘導敏感度為aglC>aglB>aglA；碳源對基因表達上調程度的影響為：水蘇糖>瓜爾豆膠>半乳糖>葡萄糖。進一步對黑曲霉zju-Y1生物質降解酶調控因子轉錄表達水平分析認為，轉錄激活因子XlnR及AmyR對α-

5、半乳糖苷酶表達基因可能存在調控作用。
　　 通過單因素實驗確定采用250 mL三角瓶固體發(fā)酵黑曲霉zju-Y1生產α-半乳糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為28℃，培養(yǎng)基初始水分含量為60％，初始pH為5.5，接種量12%，載曲量為25 g(濕基)。
　　 以農產品加工副產物(豆粕、麩皮)為主添加少量誘導物作為培養(yǎng)固體基質，經響應面優(yōu)化后得到最佳培養(yǎng)基組成為(g/10 g干基)：豆粕粉1.3782 g，麩皮8.0916 g

6、，瓜爾豆膠0.4802 g，KH2PO40.01 g，MnSO4·H2O0.04 g。用此培養(yǎng)基發(fā)酵96 h后最大酶活為265.934 U/g干基。
　　 實驗表明黑曲霉zju-Y1具有強大的水解酶酶系，在纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和酸性蛋白酶等方面均有良好的產酶能力。本文在優(yōu)化的α-半乳糖苷酶固體培養(yǎng)基為基礎上，采用響應面分析方法分別建立纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和酸性蛋白酶培養(yǎng)基組成與酶活響應值得函數模型。
　　

7、 分別設計家禽/畜用復合酶復配比例，應用窮舉法數值計算，獲得滿足設計的培養(yǎng)基組成。通過黑曲霉zju-Y1單一菌種一次發(fā)酵，獲得“以α-半乳糖苷酶為標志”的家禽用復合酶制劑A，其組成為α-半乳糖苷酶243.67 U/g干基，纖維素酶431.62 U/g干基，α-淀粉酶339.77 U/g干基，果膠酶382.19 U/g干基，酸性蛋白酶為3689.16 U/g干基；以及家畜用復合酶制劑B，其組成為α-半乳糖苷酶235.66 U/g干基，纖維

8、素酶428.17 U/g干基，α-淀粉酶362.73 U/g干基，果膠酶359.21 U/g干基，酸性蛋白酶為3614.25 U/g干基。
　　 分析復合酶制劑的酶學性質可知，以黑曲霉zju-Y1為菌株開發(fā)的復合酶制劑中各酶在40℃-60℃的反應溫度范圍和pH3.0-7.0范圍內偏酸性環(huán)境中內均能保證較好的酶活力以及穩(wěn)定性。經家禽/家畜的體外模擬消化試驗后，復合酶制劑可有效提高飼料消化率，與α-半乳糖苷酶單酶添加相比較，對寡糖的