17906.雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備及serpin缺失株的構(gòu)建

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名(手寫)：幸膃弓抖＼簽字日期：刀膨年么月留日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者

2、完全了解直昌太堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)直昌太堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名(手寫)：辛蛆峨朱＼導(dǎo)師簽名(手寫)：簽字日期：汐J2年占月2日簽字日期：辦f工年6月魯日摘要摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIII

3、IIIIlY2141610Serpin(serineproteaseinhibitor)是一種多肽類絲氨酸蛋白酶抑制劑的總稱，由350至500個氨基酸組成。2006年研究發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌的菌體表面存在著Serpin，能夠保護(hù)菌體抵抗外源蛋白酶的消化，為其粘附定植腸道提供前提條件。目前，Serpin蛋白對雙歧桿菌物質(zhì)代謝，繁殖擴(kuò)增等方面的影響不甚清楚。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株產(chǎn)Serpin蛋白的嬰兒雙歧桿菌，證實(shí)原核克隆表達(dá)的Ser

4、pin蛋白能有效抑制糜蛋白酶和胰彈性蛋白酶的活性，并促進(jìn)雙歧桿菌體外粘附細(xì)胞；本研究擬通過導(dǎo)入置換型打靶載體，構(gòu)建基因缺失株的方法，進(jìn)一步研究表面蛋白Serpin的功能。然而由于雙歧桿菌的細(xì)胞壁過厚，外源基因?qū)肜щy，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率極其低下，因此本研究一方面要獲得高活力的雙歧桿菌原生質(zhì)體，另一方面通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及同源重組獲得serpin基因缺失株。雙歧桿菌原生質(zhì)體制備的文獻(xiàn)報道甚少，本文分別評價了多種因素(生長狀態(tài)、酶解濃度、時長、溫度

5、以及不同滲透壓穩(wěn)定劑等)對長雙歧桿菌原生質(zhì)體制備的影響，獲得了長雙歧桿菌WBL001原生質(zhì)體制備及再生的優(yōu)化條件：菌體處于對數(shù)中期(OD600為20)，以棉子糖溶液(SMM)為原生質(zhì)體穩(wěn)定液，5mg／L變?nèi)芫兀?7℃孵育30min，原生質(zhì)體生成率和再生率分別達(dá)到81％和48％0，目前報道中革蘭氏陽性菌的原生質(zhì)體再生率在30％左右。在此基礎(chǔ)上，通過原生質(zhì)體的PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建的雙歧桿菌serpin的置換型打靶載體UPD導(dǎo)入雙歧桿菌，