原生質(zhì)體電融合法構(gòu)建酒精高產(chǎn)菌株.pdf

1、為得到能直接利用早秈米進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酒精的融合子，對(duì)K氏酵母與黑曲霉分別進(jìn)行物理誘變，從而篩選得到酒精高產(chǎn)菌株與糖化酶高產(chǎn)菌株。并對(duì)兩高產(chǎn)菌株分別進(jìn)行原生質(zhì)體制備實(shí)驗(yàn)，將在優(yōu)化條件下制備所得原生質(zhì)體進(jìn)行電融合，最終選出一株性能穩(wěn)定、高產(chǎn)酒精的融合子，且摸索出融合子產(chǎn)酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下： 1.K氏酵母對(duì)數(shù)生長期為4h～10h，酒精耐受性為17％(v/v)。K氏酵母經(jīng)劑量為0.4KGy的鈷源照射后得到酒精高產(chǎn)菌株

2、KC-4酵母，其酒精產(chǎn)量為8.6％(v/v)，該產(chǎn)量比原始出發(fā)菌株于同等發(fā)酵條件下提高41％。黑曲霉在劑量為0.6KGy的鈷源照射后得到產(chǎn)糖化酶高產(chǎn)菌株AC-6曲霉，其產(chǎn)糖化酶活力為1026U/g，該糖化酶活力比原始出發(fā)菌株于同等發(fā)酵條件下所產(chǎn)糖化酶活力提高16.9％。 2．KC-4最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為1號(hào)產(chǎn)孢培養(yǎng)基，且在該培養(yǎng)基上培養(yǎng)的KC-4酵母產(chǎn)孢率為78.34％。菌齡為8h，不經(jīng)β-巰基乙醇預(yù)處理及以0.8mol/L甘露醇為

3、穩(wěn)定劑時(shí)有利于KC-4原生質(zhì)體形成與再生。KC-4原生質(zhì)體形成與再生的優(yōu)化條件為：蝸牛酶濃度2％、酶解溫度30℃、酶解時(shí)間1.5h，在該條件下KC-4原生質(zhì)體形成率與再生率分別為72.4％、26.7％。AC-6原生質(zhì)體再生的最佳菌齡為12h。其原生質(zhì)體再生優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為：1.0％纖維素酶+0.5％蝸牛酶+0.5％溶茵酶，30℃，酶解3h時(shí)，AC-6原生質(zhì)體再生率達(dá)32.92％。 3．KC-4與AC-6兩者原生質(zhì)體電融合條件為：交

4、變電場頻率為1MHz，交變電場強(qiáng)度700v/cm，脈沖電場強(qiáng)度10kv/cm，脈沖寬度50μs，脈沖個(gè)數(shù)為5個(gè)，在該條件下融合率為1.6×10<'-4>，AC-6原生質(zhì)體經(jīng)紫外線單親滅活后，在該融合條件下篩選出一株性能穩(wěn)定，且酒精高產(chǎn)的融合子AK-2。其中該融合子最適生長溫度為30℃、最適生長pH為5.0、對(duì)數(shù)生長期為12h～24h及其酒精耐受度為16％(v/v)。 4．融合子AK-2生料發(fā)酵產(chǎn)酒精工藝條件：早秈米最佳粉碎度為6