miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的調(diào)控及其靶基因核酸疫苗免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、豬蛔蟲(chóng)（Ascaris suum）在分類上屬于蛔蟲(chóng)目(Ascaridida)，蛔蟲(chóng)科(Ascarididae)，蛔蟲(chóng)屬(Ascaris)，成蟲(chóng)寄生于豬的小腸，是豬腸道中最大的寄生線蟲(chóng)，呈世界性分布。就豬蛔蟲(chóng)的危害而言，一方面，豬蛔蟲(chóng)寄生消耗宿主營(yíng)養(yǎng)，數(shù)量巨大時(shí)導(dǎo)致腸道堵塞；另一方面，豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)移行會(huì)對(duì)宿主器官造成機(jī)械性損傷。雖然化學(xué)藥物可以實(shí)現(xiàn)蛔蟲(chóng)病治療，但由于長(zhǎng)期對(duì)藥物的依賴以及不科學(xué)地使用，也造成了寄生蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生以及動(dòng)物產(chǎn)品藥物

2、殘留問(wèn)題。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品健康的要求和關(guān)注度越來(lái)越高，開(kāi)發(fā)新的、環(huán)境友好型、無(wú)殘留抗寄生蟲(chóng)藥物越發(fā)顯重要。
　　MicroRNA（miRNA）是細(xì)胞內(nèi)一類非編碼小分子 RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在調(diào)節(jié)寄生蟲(chóng)發(fā)育方面有著不可或缺的作用，提示我們可以從miRNA角度出發(fā)，尋找防控寄生蟲(chóng)的新方法。DNA疫苗又稱裸DNA疫苗，是將具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表達(dá)載體，然后將此

3、重組的DNA通過(guò)注射等方式導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，在機(jī)體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，使機(jī)體獲得免疫保護(hù)的一種新型疫苗。由于DNA疫苗不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，還能像減毒活疫苗一樣誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，并且其安全性良好，所以近年來(lái)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。
　　有鑒于此，本論文工作開(kāi)展了以下兩方面的工作：
　　1.初步評(píng)價(jià)了asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育及感染性的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)豬蛔蟲(chóng)發(fā)育史miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)a

4、su-miR-36f只在豬蛔蟲(chóng)的卵和幼蟲(chóng)期特異表達(dá)，而在其他時(shí)期不表達(dá)，表明此miRNA在豬蛔蟲(chóng)的早期發(fā)育可能有重要作用。因此，設(shè)計(jì)合成了 miRNA模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitor），并通過(guò)浸泡的方法來(lái)導(dǎo)入幼蟲(chóng)體內(nèi)，檢測(cè)asu-miR-36f以及其兩個(gè)關(guān)鍵靶基因（OST48和Cyb）的表達(dá)量；然后將處理過(guò)的幼蟲(chóng)感染小鼠并進(jìn)行了幼蟲(chóng)回收和計(jì)數(shù)，初步探討其對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育和感染性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：跟對(duì)照相比，抑制劑組回收

5、幼蟲(chóng)的數(shù)量、長(zhǎng)度和寬度差異顯著，可能是由于在抑制劑的作用下，asu-miR-36f在幼蟲(chóng)體內(nèi)的水平下降，對(duì)某些靶基因的抑制作用減弱，從而對(duì)某些通路產(chǎn)生了影響，進(jìn)而對(duì)幼蟲(chóng)的發(fā)育產(chǎn)生了影響。經(jīng)過(guò)模擬物處理實(shí)驗(yàn)組的回收幼蟲(chóng)的數(shù)量、回收蟲(chóng)體的長(zhǎng)度和寬度與其他對(duì)照組相比差異不顯著，提示蟲(chóng)體內(nèi)的miRNA功能的發(fā)揮可能依賴一定的閾值限制，當(dāng)miRNA的水平高于這個(gè)閾值的時(shí)候，隨著miRNA水平的升高，miRNA的功能不再明顯加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明通過(guò)

6、浸泡的方法可以有效地將miRNA導(dǎo)入到線蟲(chóng)體內(nèi)。與基因槍、顯微注射等方法相比，此方法有簡(jiǎn)單易行，對(duì)蟲(chóng)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)。
　　2.構(gòu)建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗，評(píng)價(jià)其免疫效果。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們?cè)诒姸郺su-miR-36f的靶基因中選擇了兩個(gè)豬蛔蟲(chóng)特有的靶基因。將這兩個(gè)靶基因，通過(guò) PCR克隆、酶切、連接 pET30a質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化 DH5α、測(cè)序驗(yàn)證，并進(jìn)行BL21（DE3）原核表達(dá)后制備小鼠免疫多抗，

7、在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了pVAX1.0重組質(zhì)粒，并通過(guò)間接免疫熒光法、Western blot證實(shí)了構(gòu)建的兩個(gè)真核重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞表達(dá)，隨后進(jìn)行質(zhì)粒大量制備，通過(guò)注射方法免疫小鼠，檢測(cè)抗體水平、細(xì)胞因子水平、攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)檢測(cè)了小鼠血清中IgG抗體及IgG1、IgG2a抗體亞類、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細(xì)胞含量、細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等，綜合評(píng)價(jià)了構(gòu)建的DNA疫苗的免疫保護(hù)性作用。結(jié)

8、果表明：pVAX-NCS可以有效地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，最終的減蟲(chóng)率達(dá)35.96％；而pVAX-AG也可以引起實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是較弱，實(shí)驗(yàn)組的減蟲(chóng)率也不及pVAX-NCS組。提示pVAX-NCS對(duì)小鼠具有較好的免疫保護(hù)作用。
　　綜上所述，本研究初步評(píng)價(jià)了 asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的影響，并利用其靶基因成功構(gòu)建了DNA疫苗，為豬蛔蟲(chóng)DNA疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，因?yàn)?/p>