miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的調(diào)控及其靶基因核酸疫苗免疫效果評價.pdf

1、豬蛔蟲（Ascaris suum）在分類上屬于蛔蟲目(Ascaridida)，蛔蟲科(Ascarididae)，蛔蟲屬(Ascaris)，成蟲寄生于豬的小腸，是豬腸道中最大的寄生線蟲，呈世界性分布。就豬蛔蟲的危害而言，一方面，豬蛔蟲寄生消耗宿主營養(yǎng)，數(shù)量巨大時導致腸道堵塞；另一方面，豬蛔蟲幼蟲移行會對宿主器官造成機械性損傷。雖然化學藥物可以實現(xiàn)蛔蟲病治療，但由于長期對藥物的依賴以及不科學地使用，也造成了寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生以及動物產(chǎn)品藥物

2、殘留問題。隨著人們對環(huán)境保護和食品健康的要求和關(guān)注度越來越高，開發(fā)新的、環(huán)境友好型、無殘留抗寄生蟲藥物越發(fā)顯重要。
　　MicroRNA（miRNA）是細胞內(nèi)一類非編碼小分子 RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達。研究已經(jīng)證實，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在調(diào)節(jié)寄生蟲發(fā)育方面有著不可或缺的作用，提示我們可以從miRNA角度出發(fā)，尋找防控寄生蟲的新方法。DNA疫苗又稱裸DNA疫苗，是將具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表達載體，然后將此

3、重組的DNA通過注射等方式導入機體內(nèi)，在機體內(nèi)表達抗原蛋白，使機體獲得免疫保護的一種新型疫苗。由于DNA疫苗不僅能夠刺激機體產(chǎn)生體液免疫應答，還能像減毒活疫苗一樣誘導機體產(chǎn)生細胞免疫，并且其安全性良好，所以近年來越來越受到研究者的關(guān)注。
　　有鑒于此，本論文工作開展了以下兩方面的工作：
　　1.初步評價了asu-miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育及感染性的影響。
　　本實驗室前期通過對豬蛔蟲發(fā)育史miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)a

4、su-miR-36f只在豬蛔蟲的卵和幼蟲期特異表達，而在其他時期不表達，表明此miRNA在豬蛔蟲的早期發(fā)育可能有重要作用。因此，設計合成了 miRNA模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitor），并通過浸泡的方法來導入幼蟲體內(nèi)，檢測asu-miR-36f以及其兩個關(guān)鍵靶基因（OST48和Cyb）的表達量；然后將處理過的幼蟲感染小鼠并進行了幼蟲回收和計數(shù)，初步探討其對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育和感染性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：跟對照相比，抑制劑組回收

5、幼蟲的數(shù)量、長度和寬度差異顯著，可能是由于在抑制劑的作用下，asu-miR-36f在幼蟲體內(nèi)的水平下降，對某些靶基因的抑制作用減弱，從而對某些通路產(chǎn)生了影響，進而對幼蟲的發(fā)育產(chǎn)生了影響。經(jīng)過模擬物處理實驗組的回收幼蟲的數(shù)量、回收蟲體的長度和寬度與其他對照組相比差異不顯著，提示蟲體內(nèi)的miRNA功能的發(fā)揮可能依賴一定的閾值限制，當miRNA的水平高于這個閾值的時候，隨著miRNA水平的升高，miRNA的功能不再明顯加強。本實驗同時證明通過

6、浸泡的方法可以有效地將miRNA導入到線蟲體內(nèi)。與基因槍、顯微注射等方法相比，此方法有簡單易行，對蟲體損傷小等優(yōu)點。
　　2.構(gòu)建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗，評價其免疫效果。
　　通過生物信息學分析，我們在眾多asu-miR-36f的靶基因中選擇了兩個豬蛔蟲特有的靶基因。將這兩個靶基因，通過 PCR克隆、酶切、連接 pET30a質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化 DH5α、測序驗證，并進行BL21（DE3）原核表達后制備小鼠免疫多抗，

7、在此基礎上構(gòu)建了pVAX1.0重組質(zhì)粒，并通過間接免疫熒光法、Western blot證實了構(gòu)建的兩個真核重組質(zhì)粒能夠在真核細胞表達，隨后進行質(zhì)粒大量制備，通過注射方法免疫小鼠，檢測抗體水平、細胞因子水平、攻蟲實驗等指標檢測了小鼠血清中IgG抗體及IgG1、IgG2a抗體亞類、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細胞含量、細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等，綜合評價了構(gòu)建的DNA疫苗的免疫保護性作用。結(jié)

8、果表明：pVAX-NCS可以有效地誘導實驗小鼠產(chǎn)生體液免疫應答和細胞免疫應答，最終的減蟲率達35.96％；而pVAX-AG也可以引起實驗小鼠產(chǎn)生體液免疫應答和細胞免疫應答，但是較弱，實驗組的減蟲率也不及pVAX-NCS組。提示pVAX-NCS對小鼠具有較好的免疫保護作用。
　　綜上所述，本研究初步評價了 asu-miR-36f對豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的影響，并利用其靶基因成功構(gòu)建了DNA疫苗，為豬蛔蟲DNA疫苗的研究奠定了基礎。同時，因為