豬miR-122的靶基因鑒定、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其對(duì)PCV2復(fù)制的效應(yīng).pdf

1、每年因?yàn)樨i流行病的傳播和發(fā)病給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在這些流行病中，PCV2是一種廣泛存在的豬流行病病毒，具有很強(qiáng)的致病性，它可以與許多病原并發(fā)和繼發(fā)感染，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。有研究表明，不同的豬品種由于遺傳差異對(duì)PCV2的抗病反應(yīng)也不同。我國(guó)的地方豬種萊蕪豬較西方豬種有更好的抗PCV2的特性。miRNA

2、作為一類(lèi)單鏈非編碼小RNA分子具有在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用，在動(dòng)物的發(fā)育、增殖、分化和凋亡過(guò)程中有著重要的作用。
　　本研究主要針對(duì)萊蕪豬和大長(zhǎng)二元雜交豬對(duì)PCV2的不同抗性開(kāi)展進(jìn)一步的研究。在RNA-seq的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因的mRNA和蛋白水平的分析，熒光素酶活性檢測(cè)，確定了ssc-miR-122的靶基因。針對(duì)萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬肺組織中差異表達(dá)的miR-122的表達(dá)變化和所調(diào)控的基因進(jìn)行分析，確定了ssc-miR-122

3、啟動(dòng)子活性及其關(guān)鍵調(diào)控區(qū)，并對(duì)啟動(dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的SNP進(jìn)行了分析。最后對(duì)ssc-miR-122與PCV2復(fù)制的關(guān)系進(jìn)行了探討。研究結(jié)果如下：
　　1.miR-122表達(dá)量的檢測(cè)及靶基因的驗(yàn)證。
　?。?）利用qPCR對(duì)豬不同組織中ssc-miR-122的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明與未攻毒萊蕪豬相比，PCV2攻毒的萊蕪豬在扁桃體、脾臟中上調(diào)表達(dá)，其中在心臟中上調(diào)較明顯。在淋巴結(jié)、小腸、大腸、肝臟中有下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。與未攻毒大

4、長(zhǎng)豬相比，PCV2攻毒的大長(zhǎng)豬在扁桃體、大腸、肝臟、和脾臟中有上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，其中在肝臟中上調(diào)表達(dá)十分顯著。在淋巴結(jié)、小腸、心臟中有下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。
　?。?）利用qPCR檢測(cè)肺組織中預(yù)測(cè)靶基因NFAT5和NPEPPS的mRNA表達(dá)量變化。NFAT5和NPEPPS的表達(dá)量在攻毒與未攻毒的萊蕪豬和大長(zhǎng)豬肺組織中都是下調(diào)表達(dá)的。
　　（3）預(yù)測(cè)了miRNA的靶基因。通過(guò)Targetscan、picTar、miRanda等在線預(yù)測(cè)

5、數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ssc-miR-122的靶基因?yàn)镹PEPPS和NFAT5。其中NFAT5是激活的核因子5，是轉(zhuǎn)錄因子家族的一類(lèi)，在哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答中，NFAT5家族蛋白在誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄方面有著重要的作用。NPEPPS在MHC I類(lèi)分子的抗原加工途徑中起作用，涉及細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位前體的N-末端修飾。
　?。?）細(xì)胞水平上的驗(yàn)證。首先確定了ssc-miR-122的轉(zhuǎn)染條件為30nmol并在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)NFA

6、T5和NPEPPS的mRNA水平都顯著降低（P＜0.05）；Western blotting檢測(cè)了NFAT5和NPEPPS的蛋白水平的變化，結(jié)果表明NFAT5和NPEPPS的蛋白水平都顯著下調(diào)（P＜0.05），與mRNA水平的表達(dá)變化一致。
　?。?）Ssc-miR-122與NFAT5和NPEPPS的靶向關(guān)系。將構(gòu)建的NFAT5和NPEPPS的野生型3’UTR和突變型3’UTR的雙熒光素酶載體與ssc-miR-122 mimic共

7、轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明野生型的熒光活性顯著降低（P＜0.01），表明NFAT5和NPEPPS是Ssc-miR-122的靶基因。
　　2.萊蕪豬與大長(zhǎng)雜交豬的ssc-miR-122啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
　?。?）利用測(cè)序發(fā)現(xiàn)萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬的ssc-miR-122存在兩種片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，其中一種比另一種長(zhǎng)7bp，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析兩者活性存在顯著差異（P＜0.001）。通過(guò)啟動(dòng)子刪除實(shí)驗(yàn)確定了ssc-miR-122的核心啟

8、動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在前體上游-4587至-3594bp處存在轉(zhuǎn)錄激活活性。并在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)7bp（AACCCCC）的插入缺失突變。通過(guò)檢測(cè)7bp的完全型和缺失型啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，插入型的啟動(dòng)子活性明顯高于缺失型的啟動(dòng)子活性（P＜0.001）。通過(guò)在線預(yù)測(cè)（http://www.genomatix）分析在這7bp的插入缺失突變處存在轉(zhuǎn)錄因子CART家族的存在。
　?。?）（AACCCCC）插入缺失多態(tài)性的群體水平檢測(cè)。通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序檢測(cè)

9、了44頭萊蕪豬、49頭杜洛克豬、56頭長(zhǎng)白豬、47頭約克夏豬在該位點(diǎn)的多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)杜洛克豬沒(méi)有插入型，而長(zhǎng)白豬和約克夏豬的插入型比例高于萊蕪豬，但都不符合哈代溫伯格平衡定律，說(shuō)明存在選育的作用。
　　3. miR-122對(duì)PCV2的復(fù)制效應(yīng)
　　不同類(lèi)型啟動(dòng)子在PCV2接毒后的活性變化。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明在PCV2接毒后插入型的啟動(dòng)子活性顯著升高，而缺失型的啟動(dòng)子活性變化不明顯。通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-122，檢測(cè)miR-

10、122對(duì)PCV2復(fù)制的效應(yīng)。結(jié)果表明miR-122能明顯抑制cap蛋白的表達(dá)。說(shuō)明miR-122能有效抑制PCV2的復(fù)制。
　　綜上所述，通過(guò)本研究我們確定了萊蕪豬和大長(zhǎng)二元雜交豬肺組織中差異表達(dá)的miR-122，確定了兩個(gè)與免疫相關(guān)的靶基因。說(shuō)明miR-122可能是通過(guò)作用于NFAT5和NPEPPS這兩個(gè)靶基因的調(diào)控來(lái)參與機(jī)體免疫相關(guān)的反應(yīng)。其次對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行分析，篩選出一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)的與抗PCV2相關(guān)的分子標(biāo)記，

11、為培育對(duì)PCV2抗病性的豬提供了依據(jù)。
　　每年因?yàn)樨i流行病的傳播和發(fā)病給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在這些流行病中，PCV2是一種廣泛存在的豬流行病病毒，具有很強(qiáng)的致病性，它可以與許多病原并發(fā)和繼發(fā)感染，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。有研究表明，不同的豬品種由于遺傳差異對(duì)PCV2的抗病反應(yīng)也不同。我國(guó)的地方豬種萊

12、蕪豬較西方豬種有更好的抗PCV2的特性。miRNA作為一類(lèi)單鏈非編碼小RNA分子具有在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用，在動(dòng)物的發(fā)育、增殖、分化和凋亡過(guò)程中有著重要的作用。
　　本研究主要針對(duì)萊蕪豬和大長(zhǎng)二元雜交豬對(duì)PCV2的不同抗性開(kāi)展進(jìn)一步的研究。在RNA-seq的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因的mRNA和蛋白水平的分析，熒光素酶活性檢測(cè)，確定了ssc-miR-122的靶基因。針對(duì)萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬肺組織中差異表達(dá)的miR-122的表達(dá)變化和

13、所調(diào)控的基因進(jìn)行分析，確定了ssc-miR-122啟動(dòng)子活性及其關(guān)鍵調(diào)控區(qū)，并對(duì)啟動(dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的SNP進(jìn)行了分析。最后對(duì)ssc-miR-122與PCV2復(fù)制的關(guān)系進(jìn)行了探討。研究結(jié)果如下：
　　1. miR-122表達(dá)量的檢測(cè)及靶基因的驗(yàn)證。
　?。?）利用qPCR對(duì)豬不同組織中ssc-miR-122的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明與未攻毒萊蕪豬相比，PCV2攻毒的萊蕪豬在扁桃體、脾臟中上調(diào)表達(dá)，其中在心臟中上調(diào)較明顯。在淋

14、巴結(jié)、小腸、大腸、肝臟中有下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。與未攻毒大長(zhǎng)豬相比，PCV2攻毒的大長(zhǎng)豬在扁桃體、大腸、肝臟、和脾臟中有上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，其中在肝臟中上調(diào)表達(dá)十分顯著。在淋巴結(jié)、小腸、心臟中有下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。
　?。?）利用qPCR檢測(cè)肺組織中預(yù)測(cè)靶基因NFAT5和NPEPPS的mRNA表達(dá)量變化。NFAT5和NPEPPS的表達(dá)量在攻毒與未攻毒的萊蕪豬和大長(zhǎng)豬肺組織中都是下調(diào)表達(dá)的。
　?。?）預(yù)測(cè)了miRNA的靶基因。通過(guò)Targ

15、etscan、picTar、miRanda等在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ssc-miR-122的靶基因?yàn)镹PEPPS和NFAT5。其中NFAT5是激活的核因子5，是轉(zhuǎn)錄因子家族的一類(lèi)，在哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答中，NFAT5家族蛋白在誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄方面有著重要的作用。NPEPPS在MHC I類(lèi)分子的抗原加工途徑中起作用，涉及細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位前體的N-末端修飾。
　?。?）細(xì)胞水平上的驗(yàn)證。首先確定了ssc-miR-122的轉(zhuǎn)染條件為30nmol并

16、在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)NFAT5和NPEPPS的mRNA水平都顯著降低（P＜0.05）；Western blotting檢測(cè)了NFAT5和NPEPPS的蛋白水平的變化，結(jié)果表明NFAT5和NPEPPS的蛋白水平都顯著下調(diào)（P＜0.05），與mRNA水平的表達(dá)變化一致。
　?。?）Ssc-miR-122與NFAT5和NPEPPS的靶向關(guān)系。將構(gòu)建的NFAT5和NPEPPS的野生型3’UTR和突變型3’UTR的

17、雙熒光素酶載體與ssc-miR-122 mimic共轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明野生型的熒光活性顯著降低（P＜0.01），表明NFAT5和NPEPPS是Ssc-miR-122的靶基因。
　　2.萊蕪豬與大長(zhǎng)雜交豬的ssc-miR-122啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
　?。?）利用測(cè)序發(fā)現(xiàn)萊蕪豬和大長(zhǎng)雜交豬的ssc-miR-122存在兩種片段長(zhǎng)度的啟動(dòng)子，其中一種比另一種長(zhǎng)7bp，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析兩者活性存在顯著差異（P＜0.001）。通

18、過(guò)啟動(dòng)子刪除實(shí)驗(yàn)確定了ssc-miR-122的核心啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在前體上游-4587至-3594bp處存在轉(zhuǎn)錄激活活性。并在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)7bp（AACCCCC）的插入缺失突變。通過(guò)檢測(cè)7bp的完全型和缺失型啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，插入型的啟動(dòng)子活性明顯高于缺失型的啟動(dòng)子活性（P＜0.001）。通過(guò)在線預(yù)測(cè)（http://www.genomatix）分析在這7bp的插入缺失突變處存在轉(zhuǎn)錄因子CART家族的存在。
　?。?）（AACCCCC）插

19、入缺失多態(tài)性的群體水平檢測(cè)。通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序檢測(cè)了44頭萊蕪豬、49頭杜洛克豬、56頭長(zhǎng)白豬、47頭約克夏豬在該位點(diǎn)的多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)杜洛克豬沒(méi)有插入型，而長(zhǎng)白豬和約克夏豬的插入型比例高于萊蕪豬，但都不符合哈代溫伯格平衡定律，說(shuō)明存在選育的作用。
　　3.miR-122對(duì)PCV2的復(fù)制效應(yīng)
　　不同類(lèi)型啟動(dòng)子在PCV2接毒后的活性變化。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明在PCV2接毒后插入型的啟動(dòng)子活性顯著升高，而缺失型的啟動(dòng)子活性

20、變化不明顯。通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-122，檢測(cè)miR-122對(duì)PCV2復(fù)制的效應(yīng)。結(jié)果表明miR-122能明顯抑制cap蛋白的表達(dá)。說(shuō)明miR-122能有效抑制PCV2的復(fù)制。
　　綜上所述，通過(guò)本研究我們確定了萊蕪豬和大長(zhǎng)二元雜交豬肺組織中差異表達(dá)的miR-122，確定了兩個(gè)與免疫相關(guān)的靶基因。說(shuō)明miR-122可能是通過(guò)作用于NFAT5和NPEPPS這兩個(gè)靶基因的調(diào)控來(lái)參與機(jī)體免疫相關(guān)的反應(yīng)。其次對(duì)miR-122的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行分析