豬miR-122的靶基因鑒定、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其對PCV2復制的效應.pdf

1、每年因為豬流行病的傳播和發(fā)病給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，在這些流行病中，PCV2是一種廣泛存在的豬流行病病毒，具有很強的致病性，它可以與許多病原并發(fā)和繼發(fā)感染，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。有研究表明，不同的豬品種由于遺傳差異對PCV2的抗病反應也不同。我國的地方豬種萊蕪豬較西方豬種有更好的抗PCV2的特性。miRNA

2、作為一類單鏈非編碼小RNA分子具有在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用，在動物的發(fā)育、增殖、分化和凋亡過程中有著重要的作用。
　　本研究主要針對萊蕪豬和大長二元雜交豬對PCV2的不同抗性開展進一步的研究。在RNA-seq的基礎上，通過檢測預測靶基因的mRNA和蛋白水平的分析，熒光素酶活性檢測，確定了ssc-miR-122的靶基因。針對萊蕪豬和大長雜交豬肺組織中差異表達的miR-122的表達變化和所調(diào)控的基因進行分析，確定了ssc-miR-122

3、啟動子活性及其關鍵調(diào)控區(qū)，并對啟動子的關鍵調(diào)控區(qū)的SNP進行了分析。最后對ssc-miR-122與PCV2復制的關系進行了探討。研究結(jié)果如下：
　　1.miR-122表達量的檢測及靶基因的驗證。
　　（1）利用qPCR對豬不同組織中ssc-miR-122的表達量進行了檢測。結(jié)果表明與未攻毒萊蕪豬相比，PCV2攻毒的萊蕪豬在扁桃體、脾臟中上調(diào)表達，其中在心臟中上調(diào)較明顯。在淋巴結(jié)、小腸、大腸、肝臟中有下調(diào)的表達趨勢。與未攻毒大

4、長豬相比，PCV2攻毒的大長豬在扁桃體、大腸、肝臟、和脾臟中有上調(diào)表達的趨勢，其中在肝臟中上調(diào)表達十分顯著。在淋巴結(jié)、小腸、心臟中有下調(diào)表達的趨勢。
　?。?）利用qPCR檢測肺組織中預測靶基因NFAT5和NPEPPS的mRNA表達量變化。NFAT5和NPEPPS的表達量在攻毒與未攻毒的萊蕪豬和大長豬肺組織中都是下調(diào)表達的。
　?。?）預測了miRNA的靶基因。通過Targetscan、picTar、miRanda等在線預測

5、數(shù)據(jù)庫預測ssc-miR-122的靶基因為NPEPPS和NFAT5。其中NFAT5是激活的核因子5，是轉(zhuǎn)錄因子家族的一類，在哺乳動物的免疫應答中，NFAT5家族蛋白在誘導基因轉(zhuǎn)錄方面有著重要的作用。NPEPPS在MHC I類分子的抗原加工途徑中起作用，涉及細胞毒性T細胞表位前體的N-末端修飾。
　?。?）細胞水平上的驗證。首先確定了ssc-miR-122的轉(zhuǎn)染條件為30nmol并在轉(zhuǎn)染后48h達到最佳轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后，細胞內(nèi)NFA

6、T5和NPEPPS的mRNA水平都顯著降低（P＜0.05）；Western blotting檢測了NFAT5和NPEPPS的蛋白水平的變化，結(jié)果表明NFAT5和NPEPPS的蛋白水平都顯著下調(diào)（P＜0.05），與mRNA水平的表達變化一致。
　?。?）Ssc-miR-122與NFAT5和NPEPPS的靶向關系。將構(gòu)建的NFAT5和NPEPPS的野生型3’UTR和突變型3’UTR的雙熒光素酶載體與ssc-miR-122 mimic共

7、轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明野生型的熒光活性顯著降低（P＜0.01），表明NFAT5和NPEPPS是Ssc-miR-122的靶基因。
　　2.萊蕪豬與大長雜交豬的ssc-miR-122啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
　?。?）利用測序發(fā)現(xiàn)萊蕪豬和大長雜交豬的ssc-miR-122存在兩種片段長度的啟動子，其中一種比另一種長7bp，通過雙熒光素酶報告基因分析兩者活性存在顯著差異（P＜0.001）。通過啟動子刪除實驗確定了ssc-miR-122的核心啟

8、動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在前體上游-4587至-3594bp處存在轉(zhuǎn)錄激活活性。并在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個7bp（AACCCCC）的插入缺失突變。通過檢測7bp的完全型和缺失型啟動子發(fā)現(xiàn)，插入型的啟動子活性明顯高于缺失型的啟動子活性（P＜0.001）。通過在線預測（http://www.genomatix）分析在這7bp的插入缺失突變處存在轉(zhuǎn)錄因子CART家族的存在。
　　（2）（AACCCCC）插入缺失多態(tài)性的群體水平檢測。通過PCR擴增和測序檢測

9、了44頭萊蕪豬、49頭杜洛克豬、56頭長白豬、47頭約克夏豬在該位點的多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)杜洛克豬沒有插入型，而長白豬和約克夏豬的插入型比例高于萊蕪豬，但都不符合哈代溫伯格平衡定律，說明存在選育的作用。
　　3. miR-122對PCV2的復制效應
　　不同類型啟動子在PCV2接毒后的活性變化。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果表明在PCV2接毒后插入型的啟動子活性顯著升高，而缺失型的啟動子活性變化不明顯。通過過表達miR-122，檢測miR-

10、122對PCV2復制的效應。結(jié)果表明miR-122能明顯抑制cap蛋白的表達。說明miR-122能有效抑制PCV2的復制。
　　綜上所述，通過本研究我們確定了萊蕪豬和大長二元雜交豬肺組織中差異表達的miR-122，確定了兩個與免疫相關的靶基因。說明miR-122可能是通過作用于NFAT5和NPEPPS這兩個靶基因的調(diào)控來參與機體免疫相關的反應。其次對miR-122的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行分析，篩選出一個啟動子區(qū)的與抗PCV2相關的分子標記，

11、為培育對PCV2抗病性的豬提供了依據(jù)。
　　每年因為豬流行病的傳播和發(fā)病給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，在這些流行病中，PCV2是一種廣泛存在的豬流行病病毒，具有很強的致病性，它可以與許多病原并發(fā)和繼發(fā)感染，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。有研究表明，不同的豬品種由于遺傳差異對PCV2的抗病反應也不同。我國的地方豬種萊

12、蕪豬較西方豬種有更好的抗PCV2的特性。miRNA作為一類單鏈非編碼小RNA分子具有在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用，在動物的發(fā)育、增殖、分化和凋亡過程中有著重要的作用。
　　本研究主要針對萊蕪豬和大長二元雜交豬對PCV2的不同抗性開展進一步的研究。在RNA-seq的基礎上，通過檢測預測靶基因的mRNA和蛋白水平的分析，熒光素酶活性檢測，確定了ssc-miR-122的靶基因。針對萊蕪豬和大長雜交豬肺組織中差異表達的miR-122的表達變化和

13、所調(diào)控的基因進行分析，確定了ssc-miR-122啟動子活性及其關鍵調(diào)控區(qū)，并對啟動子的關鍵調(diào)控區(qū)的SNP進行了分析。最后對ssc-miR-122與PCV2復制的關系進行了探討。研究結(jié)果如下：
　　1. miR-122表達量的檢測及靶基因的驗證。
　?。?）利用qPCR對豬不同組織中ssc-miR-122的表達量進行了檢測。結(jié)果表明與未攻毒萊蕪豬相比，PCV2攻毒的萊蕪豬在扁桃體、脾臟中上調(diào)表達，其中在心臟中上調(diào)較明顯。在淋

14、巴結(jié)、小腸、大腸、肝臟中有下調(diào)的表達趨勢。與未攻毒大長豬相比，PCV2攻毒的大長豬在扁桃體、大腸、肝臟、和脾臟中有上調(diào)表達的趨勢，其中在肝臟中上調(diào)表達十分顯著。在淋巴結(jié)、小腸、心臟中有下調(diào)表達的趨勢。
　?。?）利用qPCR檢測肺組織中預測靶基因NFAT5和NPEPPS的mRNA表達量變化。NFAT5和NPEPPS的表達量在攻毒與未攻毒的萊蕪豬和大長豬肺組織中都是下調(diào)表達的。
　?。?）預測了miRNA的靶基因。通過Targ

15、etscan、picTar、miRanda等在線預測數(shù)據(jù)庫預測ssc-miR-122的靶基因為NPEPPS和NFAT5。其中NFAT5是激活的核因子5，是轉(zhuǎn)錄因子家族的一類，在哺乳動物的免疫應答中，NFAT5家族蛋白在誘導基因轉(zhuǎn)錄方面有著重要的作用。NPEPPS在MHC I類分子的抗原加工途徑中起作用，涉及細胞毒性T細胞表位前體的N-末端修飾。
　　（4）細胞水平上的驗證。首先確定了ssc-miR-122的轉(zhuǎn)染條件為30nmol并

16、在轉(zhuǎn)染后48h達到最佳轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后，細胞內(nèi)NFAT5和NPEPPS的mRNA水平都顯著降低（P＜0.05）；Western blotting檢測了NFAT5和NPEPPS的蛋白水平的變化，結(jié)果表明NFAT5和NPEPPS的蛋白水平都顯著下調(diào)（P＜0.05），與mRNA水平的表達變化一致。
　?。?）Ssc-miR-122與NFAT5和NPEPPS的靶向關系。將構(gòu)建的NFAT5和NPEPPS的野生型3’UTR和突變型3’UTR的

17、雙熒光素酶載體與ssc-miR-122 mimic共轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明野生型的熒光活性顯著降低（P＜0.01），表明NFAT5和NPEPPS是Ssc-miR-122的靶基因。
　　2.萊蕪豬與大長雜交豬的ssc-miR-122啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
　?。?）利用測序發(fā)現(xiàn)萊蕪豬和大長雜交豬的ssc-miR-122存在兩種片段長度的啟動子，其中一種比另一種長7bp，通過雙熒光素酶報告基因分析兩者活性存在顯著差異（P＜0.001）。通

18、過啟動子刪除實驗確定了ssc-miR-122的核心啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)在前體上游-4587至-3594bp處存在轉(zhuǎn)錄激活活性。并在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個7bp（AACCCCC）的插入缺失突變。通過檢測7bp的完全型和缺失型啟動子發(fā)現(xiàn)，插入型的啟動子活性明顯高于缺失型的啟動子活性（P＜0.001）。通過在線預測（http://www.genomatix）分析在這7bp的插入缺失突變處存在轉(zhuǎn)錄因子CART家族的存在。
　?。?）（AACCCCC）插

19、入缺失多態(tài)性的群體水平檢測。通過PCR擴增和測序檢測了44頭萊蕪豬、49頭杜洛克豬、56頭長白豬、47頭約克夏豬在該位點的多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)杜洛克豬沒有插入型，而長白豬和約克夏豬的插入型比例高于萊蕪豬，但都不符合哈代溫伯格平衡定律，說明存在選育的作用。
　　3.miR-122對PCV2的復制效應
　　不同類型啟動子在PCV2接毒后的活性變化。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果表明在PCV2接毒后插入型的啟動子活性顯著升高，而缺失型的啟動子活性

20、變化不明顯。通過過表達miR-122，檢測miR-122對PCV2復制的效應。結(jié)果表明miR-122能明顯抑制cap蛋白的表達。說明miR-122能有效抑制PCV2的復制。
　　綜上所述，通過本研究我們確定了萊蕪豬和大長二元雜交豬肺組織中差異表達的miR-122，確定了兩個與免疫相關的靶基因。說明miR-122可能是通過作用于NFAT5和NPEPPS這兩個靶基因的調(diào)控來參與機體免疫相關的反應。其次對miR-122的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行分析