HER2胞外區(qū)基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、目的:原癌基因HER2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的一員，具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，包括信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)四個(gè)部分。HER2在正常細(xì)胞中含量很低，但在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等組織細(xì)胞中表達(dá)量很高，其表達(dá)與腫瘤病程的進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。HER2胞外區(qū)定位于腫瘤細(xì)胞表面，使其成為腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。本研究的目的是構(gòu)建HER2蛋白重組表

2、達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)HER2胞外區(qū)蛋白，為后續(xù)HER2抗體及腫瘤蛋白疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)HER2胞外區(qū)模板的克隆:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人乳腺癌細(xì)胞SKBR-3中克隆出HER2的整個(gè)胞外區(qū)基因。(2)表達(dá)載體的構(gòu)建:以克隆的HER2胞外區(qū)為模板，采用PCR分別擴(kuò)增出HER2胞外區(qū)的遠(yuǎn)膜端和近膜端基因片段，將之分別插入表達(dá)載體pET28a和pET30a構(gòu)建重組表達(dá)載體。采用載體上T7通用引物對(duì)構(gòu)建好的表達(dá)載

3、體進(jìn)行測(cè)序。(3)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中，加入IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-blotting考察蛋白是否成功表達(dá)。(4)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化:通過改變誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，尋找最佳表達(dá)條件，使目的蛋白的表達(dá)量最高。
　　 結(jié)果:(1)瓊脂糖凝膠電泳顯示在接近2000bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶，表明HER2胞外區(qū)模板克隆成功。(2)重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表