單抗夾心ELISA檢測(cè)雞新城疫病毒抗原的研究.pdf

1、該文分為兩部分.第一部分是鼠抗新城疫病毒(Newcastle Disease Virus NDV)單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性鑒定,第二部分是應(yīng)用自制單抗建立夾心ELISA試驗(yàn)方法并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.蔗糖密度梯度超速離心法純化NDV效果良好.接種NDV F48E9株于1 0~11日齡雞胚尿囊腔,平均每枚雞胚收獲尿囊液約8mL,血凝價(jià)(HA效價(jià))在2<'9>~2<'12>之間.尿囊液粗提后再經(jīng)20~60％、梯度為20％的蔗糖密度梯度

2、超速離心法進(jìn)一步純化,在40~60％的蔗糖梯度層有一乳白色的病毒帶.透析后,測(cè)其HA效價(jià)高達(dá)2<'15>,較純化前有明顯提高.用Folin酚法測(cè)得病毒的蛋白濃度約為1mg/mL.建立了篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的間接ELISA試驗(yàn)方法并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.當(dāng)純化的NDV抗原每孔包被47ng,酶標(biāo)抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1:800時(shí),陽(yáng)性對(duì)照的OD492值大于1.0,而陰性對(duì)照的OD492值小于0.1.分別用鼠抗NDV抗血清和健康鼠血

3、清作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照,對(duì)照血清的稀釋度為1:1600.用蔗糖密度梯度超速離心法純化的NDV作為抗原,按常規(guī)方法免疫6~8周齡雌性Balb/C小鼠.小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按2:1至5:1的比例混合,經(jīng)50％PEG 4000融合后,HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)10~12天進(jìn)行陽(yáng)性篩選.融合細(xì)胞分置6塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),共576孔,其中391孔有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng),融合率為67.9％;經(jīng)間接ELISA檢測(cè)上清得陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)40,陽(yáng)性率為6.

4、9％.挑選出其中OD492值在1.0以上的孔共10孔進(jìn)行有限稀釋法克隆或亞克隆.最終得到3株能穩(wěn)定分泌抗體并產(chǎn)生腹水的雜交瘤細(xì)胞3株,分別命名為1F9、1C6、4D5.按5×10<'5>細(xì)胞/0.2 mL/只的量將3株雜交瘤細(xì)胞分別注入小鼠腹腔,約15天后,小鼠腹部明顯漲大,用注射器分次收集腹水,腹水呈黃色至淡血紅色不等.平均每只小鼠可獲4~5mL腹水.應(yīng)用辛酸-硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行純化,蛋白得率為28.2％~31.4％.對(duì)3株單抗的部分

5、生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,結(jié)果為:三株單抗均具有較高的ELISA效價(jià)(1.5×10<'4>~1×10<'5>);1 F9、4D5兩株單抗同時(shí)具有較高的HI效價(jià)(2<'9>,2<'8>),而中和效價(jià)(VN)偏低(二者都小于1 0);單抗1C6株具有較高的VN效價(jià)(10<'3>),卻無(wú)血凝抑制能力(HI效價(jià)為0).配對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果顯示:1C6、4D5分別作為包被單抗和酶標(biāo)記單抗時(shí),ELISA反應(yīng)有較高的OD492值,系統(tǒng)的敏感性較其它組合要高.在此

6、基礎(chǔ)上建立了單抗夾心ELISA試驗(yàn)方法,并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.試驗(yàn)結(jié)果表明:酶標(biāo)板經(jīng)紫外線照射處理,包被單抗1C6、酶標(biāo)單抗4D5-HRP分別作800倍、1600倍稀釋,包被液、封閉液、酶標(biāo)抗體稀釋液分別選用0.05mol/L pH9.6 Na<,2>CO<,3>-NaHCO<,3>、1％BSA和4％NCS-PBS,酶標(biāo)抗體和底物分別作用30min和15min時(shí)所測(cè)得的陽(yáng)性O(shè)D492值相對(duì)較高,陽(yáng)性O(shè)D492值與陰性O(shè)D492值之比最