雙抗原夾心ELISA檢測丙型肝炎病毒總抗體的初步研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一種危害嚴重的傳染病，HCV感染呈世界性分布，在我國HCV感染者約有4000萬。為了控制HCV經血液傳播，國家要求對獻血者進行抗-HCV的檢測。目前國內外HCV抗體檢測試劑均已開發(fā)了三代產品。第三代ELISA檢測試劑的質量，較前兩代均有了很大提高，但還存在一定程度的漏檢和假陽性，如何提高HCV抗體試劑的質量仍是一個亟待解決的問題。 在ELISA方法上，目前抗-HCV檢測試劑均采用間接

2、法，即用酶免疫標記的抗人IgG為第二抗體，檢測血清中卜ICV抗體IgG。由于IgG抗體出現(xiàn)時間較晚，對早期感染易產生漏檢；同時，由于血清中非特異性物質的吸附及類風濕因子等干擾，容易產生假陽性反應；另外，ELISA試劑盒使用的許多基因工程表達抗原都有融合末端，其抗原性可影響抗體檢測，有時也會產生假陽性反應。 而雙抗原夾心法ELISA使用的試劑從根本上更換了酶結合物質，使得試劑對受檢樣品的特異性大大提高；同時，雙抗原夾心法ELISA

3、檢測的是總抗體，除IgG之外，還可以檢測到IgM、IgA等。在感染早期，由于IgM抗體比IgG出現(xiàn)早，雙抗原夾心法就可以縮短檢測的窗口期，因而此種方法檢測的敏感性高。應用雙抗原夾心ELISA法來代替間接ELISA法，可以大大提高診斷試劑的敏感性與特異性，此法己在乙肝表面抗體、梅毒抗體、HlV抗體等的檢測中得到了成功的應用，但在抗-HCV的檢測中目前還處于研究階段。 我們采用HCV 1-5基因型嵌合NS4抗原代替單一基因型的NS4

4、抗原，以減少由于HCv基因變異對檢測可能造成的影響；用融合六個組氨酸的抗原來包被酶標板，用融合GST的抗原來作酶標抗原，以消除融合末端對檢測的影響。通過這些改進，本研究旨在建立一種敏感性高、特異性強的HCV雙抗原夾心ELISA檢測法，并初步探討其在HCV抗體檢測中的意義。本研究分為如下兩個部分： 一、HCV不同基因編碼區(qū)重組質粒的構建與重組抗原的表達和純化： 以能表達lItCV core、NS3和NS4 GST融合蛋白的

5、三種重組質粒C-pGEX-4T-2、NS3-pGEX-4T-2和NS4-pGEX-4T-2為模板，分別構建了能表達HCV core、NS3和NS4 His融合蛋白的另外三種重組表達質粒C-pET-28a-c(+)、NS3-pET-28a-c(+)和NS4-pET-28a-c(+)；重組質粒經PCR和雙酶切鑒定，各重組質粒構建成功；重組質粒測序結果顯示，插入的片段大小及閱讀框架全部正確；從IPTG濃度、誘導表達時間與溫度三個方面對蛋白表達

6、條件進行了優(yōu)化：用NTA.Ni柱純化融合六個組氨酸的HCV重組抗原(H-C、H-NS3和H-NS4)，用Glutathione Sepharose<'TM>柱子純化融合GST的重組抗原(G-C、G-NS3和G-NS4).最后經SDS-PAGE鑒定，純化到的六種HCV重組抗原純度均較高，經蛋白定量測定后濃度分別為：H-C為1.35mg/ml(尿素變性)；G-C為0.812mg/ml；H-NS3為1.14mg/ml；G-NS3為1.31mg

7、/ml；H-NS4為3.28mg/ml(尿素變性)；G-NS4為1.62mg/ml。 二、HCV抗原的HRP標記以及HCV抗體雙抗原夾心ELISA的建立與評價： 采用改良過碘酸鈉法，標記了三種HCV重組抗原(G-C、G-NS3和G-NS4)。使用已知抗-HCV陽性混合血清和陰性混合血清，從包被抗原、酶標記抗原二個方面進行方陣滴定，建立了單片段抗原夾心ELISA。方陣滴定結果顯示，抗-HCV的C抗體檢測時，包被抗原H-C的

8、濃度為30μg/ml，酶標抗原G-C稀釋度為1:3000；抗-HCV的NS4抗體檢測時，包被抗原H-NS4濃度為30 μg/ml，酶標抗原G-NS4稀釋度為1:1000；抗-HCV的NS3抗體檢測時，包被抗原H-NS3濃度為30 μg/ml，酶標抗原G-NS3稀釋度為1:1000。單片段夾心ELISA方陣滴定結果，可以得出的結論是酶標抗原G-C的工作稀釋度分別是G-NS3、G-NS4的三倍，而G-NS3、G-NS4工作稀釋度相同。

9、 用己知抗-HCV陽性混合血清和陰性混合血清lOOul/孔；抗原H-C、H-NS3、H-NS4按摩爾比1:1:0.5的比例混合用作包被抗原；標記后的抗原混合比例與包被抗原的混合比例相對應，按1:3:1.5(根據單片段抗原夾心ELISA方陣滴定結果求得)混合作第二抗原，重新方陣滴定，建立了雙抗原夾心ELISA。方陣滴定結果顯示，混合包被抗原工作濃度為50μg/ml，混合酶標抗原的工作稀釋度為1:200。同時，分別從包被緩沖液、聚苯乙烯微

10、孔板、封閉液、酶標抗原稀釋液、標本稀釋度等方面，優(yōu)化了實驗條件。 用間接ELISA(萬泰試劑)與雙抗原夾心ELISA，同時檢測了收集自南京市第二人民醫(yī)院檢驗科的1968份血清標本，其中有17份血清標本在兩種檢測方法中檢測結果不相符，又用HCV RNA套式RT-PCR檢測了這17份血清標本，發(fā)現(xiàn)14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標本中只有1份標本的HCV RNA陽性，3份間接法陰性而夾心法陽性的血清標本中有2份標本的HC

11、V RNA陽性。雙抗原夾心法與間接ELISA法總體符合率為99.1％；以兩種ELISA檢測抗-HCV均陽性為HCV真陽性，而以兩種ELISA檢測抗-HCV均陰性為真陰性，再結合套式RT-PCR的結果，可以得出：來自二院的這1968份血清標本中，HCV的感染率為9.8％(193P1968)；本實驗所建立的雙抗原夾心法ELISA與間接法ELISA(北京萬泰)的敏感性分別為99.4％和98.9％；特異性分別為99.9％和99.2％。

12、此外，用套式RT-PCR檢測了31份間接法與夾心ELISA法抗-HCV均陽性的血清標本，發(fā)現(xiàn)有23份血清HCV RNA陽性，HCV RNA陽性率為74.2％(23/31)，遠遠高于14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標本的陽性率7.1％(1/14)。提示間接法檢測抗-HCV IgG可能存在一定比例的假陽性。 綜上所述，我們建立的檢測HCV抗體的雙抗原夾心法ELISA具有較高的敏感性和特異性，有望用于臨床HCV感染的診斷和