15368.茶樹類黃酮基因功能驗證相關(guān)體系的篩選

1、I摘要摘要茶樹中的茶多酚如兒茶素、黃酮醇和原花青素化合物的生物合成途徑及其涉及的酶類基本已經(jīng)清晰，但對控制相關(guān)酶類的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因及其功能并未得到有效驗證。主要的困難是茶樹穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因體系難以建立，茶樹再生體系周期長效率低。提高茶樹再生體系的效率、嘗試建立茶樹瞬時遺傳轉(zhuǎn)化體系依然是當前努力的目標。借助模式植物的轉(zhuǎn)基因體系驗證茶樹相關(guān)基因的功能則是另一種選擇。本論文在這些方面做了一些探討主要結(jié)果如下:1、茶樹一種再生體系的建立本試驗建

2、立了一種以茶樹農(nóng)抗早種子為外植體—胚性愈傷組織誘導(dǎo)—胚性愈傷組織增殖—不定芽誘導(dǎo)—不定芽增殖—體外生根的茶樹組培再生體系。該再生體系具有兩步增殖階段，即愈傷組織增殖和不定芽增殖。具體步驟為：采集9月初的茶籽為外植體，經(jīng)消毒后培養(yǎng)在添加了2，4D（0.5mgL）和KT（0.1mgL）的B5培養(yǎng)基中，2周后有愈傷組織長出，愈傷組織繼代培養(yǎng)于該培養(yǎng)基中，可穩(wěn)定繼代4年；將獲得的愈傷組織培養(yǎng)于添加了IBA（0.1mgL）6BA（2.0mgL）的

3、MS培養(yǎng)基中，4周后芽的誘導(dǎo)率可以達到65.71%；將誘導(dǎo)出的芽培養(yǎng)于添加IBA（0.1mgL）和TDZ（0.01mgL）的MS培養(yǎng)基中，4周后發(fā)出大量叢生芽；將叢生芽培養(yǎng)于添加了IBA（0.2mgL）的MS培養(yǎng)基中進行壯苗；選取5cm以上的粗壯茶苗直接培養(yǎng)于土壤中，5個月后存活率高達80.8%，整個周期約為25周。2、基于茶樹愈傷組織為材料的基因瞬時表達體系的研究本研究選用SPSS17.0正交試驗軟件，對根癌農(nóng)桿菌EHA105侵染的4

4、個條件（菌液OD值、侵染時間、共培養(yǎng)天數(shù)及乙酰丁香酮AS用量）進行優(yōu)化，試驗結(jié)果表明，以上述農(nóng)抗早愈傷組織為材料，以GUS為報告基因，菌液OD值為0.6、侵染時間為30分鐘、AS用量為9.8mgL、共培養(yǎng)天數(shù)為5天時，侵染率可以達到34.15%。來自龍井43的愈傷組織侵染率高于農(nóng)抗早。組織定位分析顯示，外源基因可以在茶樹愈傷組織中表達，但是表達率隨著時間的推移逐步下降。3、利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系驗證茶樹類黃酮合成相關(guān)基因功能對基于除草劑篩

5、選的煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系是否能驗證茶樹類黃酮合成相關(guān)基因功能進行了研究。試驗發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因煙草花色的變化可以方便驗證茶樹類黃酮合成相關(guān)基因的功能，但是必須注意野生型煙草花中花青素的含量呈現(xiàn)初開較低，盛開當天達到最高，之后逐漸降低的規(guī)律；溫度影響野生型煙草花中花青素的合成，溫度越高，花色越淺。本研究選擇帶有目的基因CsANR的根癌農(nóng)桿菌EHA105侵染煙草G28，經(jīng)過脫菌、草銨膦除草劑篩選、煙草再生培養(yǎng)，最終獲得帶有茶樹ANR的轉(zhuǎn)基因煙草；